小鼠哮喘模型肺组织中STAT1活性变化及其对ICAM.docx
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1、小鼠哮喘模型肺组织中STAT1活性变化及其对ICAM1表达的影响【摘要】目的 探讨信号转导和转录激活子1DNA结合活性在小鼠哮喘模型的肺中不同时间点的变化及其对细胞间黏附分子1表达的调控作用。 方法用鸡卵白蛋白(OVA)抗原溶液腹腔注射致敏,雾化吸入激发制备哮喘小鼠模型,造模后凝胶迁移滞留试验的方法测定病变肺组织中STAT1 DNA结合活性在模型组不同时间点(8 h、24 h、48 h、96 h、7 d)的变化;PCR法测定ICAM1mRNA在上述时间点的表达,设生理盐水对照组。设生理盐水对照组为0 h时间组。结果 造模后肺STAT1明显活化,96 h达到最高峰;ICAM1mRNA与蛋白表达在
2、8 h开始有所增加,96 h达高峰。STAT1 DNA结合活性及ICAM1表达呈高度正相关。对照组则无明显改变。结论 哮喘模型的病变肺组织STAT1 DNA结合活性的持续与异常升高,STAT1参与鸡卵白蛋白诱导的小鼠哮喘的发生和;ICAM1在模型的不同时间点表达增加,可能受到STAT1调控。 【关键词】小鼠 鸡卵白蛋白 哮喘 动物模型 转录 黏附分子 Abstract:Objective To detect the change of DNAbinding activity of STAT1 in various time and expression of intercellular adh
3、esion molecule1whichwas regulated by STAT1 in the mice model with electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and PCR. Methods Mice were randomized into different groups: asthma group and normal control group. Mice in model group were sensitized by intraperitoneal injection and Al(OH)3 on 0,14 d. On
4、 18,19,20 d,the animals were challenged with 10 g/L OVA aerosol for 20 min.Themodels were divided into 6 groups which were killed at 0 h,8 h,24 h,48 h,96 h,7 d. Activity of STAT1 DNAbinding was detected by electrophoresis mobility shift assays (EMSA) at various time points. Expression of ICAM1 was d
5、etected by PCR. Results The binding activity of STAT1 increased with a dynamic curve in experimental groups. It began to increase at 8 h point time and reached to peak at 96 h,then decreased but still keep obviously higher at 7 d versus control group (). Levels of ICAM1 mRNA significantly elevated a
6、t 8 h and the peak was at 7 d. Conclusions STAT1 activation is an important factor that may be involved in acute and chronic inflammation development. STAT1 also regulated ICAM1 expression during asthma.Key words:mice; OVA; asthma; animal model; transcription; intercellular adhesion molecule支气管哮喘(br
7、onchial asthma,BA)是一种气道非特异性炎症性疾病,在我国发病率比较高,严重 影响 患者的身心健康和生活质量,给及家庭造成了严重的负担。随着 研究 的深入,细胞信号转导途径对哮喘的作用越来越受重视,特别是信号转导和转录激活子1,成为揭示哮喘发病机制的一个新的途径。STAT1是连接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的主要蛋白质,在细胞因子调节中起着重要作用。本文旨在通过建立小鼠的哮喘模型,研究STAT1在哮喘发病过程中对ICAM1基因的转录调节作用,有助于从基因转录调节的水平寻找哮喘 治疗 的新靶点。1 材料与方法11 实验方法实验动物分组 36只6周BALA/C小鼠,购自广
8、东院动物实验中心,体质量1014 g,合格证号:2005A025。按随机区组设计随机分为6组:生理盐水组,模型组(造模后8 h,24 h,48 h,96 h,7 d 5个时间点处死,各6只)。实验方法:第1日每只小鼠腹腔注射20 g 卵白蛋白(OVA)和2 mg氢氧化铝混合于 mL 磷酸盐缓冲液(PBS)中;第 8 天注射10 g OVA 和1 mg 氢氧化铝。第15 天开始将小鼠置于封闭容器中,给予5% OVA 和 PBS雾化吸入激发哮喘发作; 均每日 1 次,每次25 min,连续7 d;造模成功后,按上述时间点处死动物。标本处理:造模后放血处死小鼠,从每时间点组迅速取出肺组织,小部分作H
9、E病理 分析 ,其余部分液氮-70 冷冻保存留待EMSA分析STAT1,RTPCR分析ICAM1 mRNA表达。凝胶迁移滞留试验检测肺组织STAT1核蛋白的提取 从液氮中取出肺组织,隔铝箔纸捣碎。裂解缓冲A液312 L溶解粉末,0 匀浆1020次。0 ,2 000 r/min,离心15 s。弃沉淀,保留上清液冰浴5 min。0 ,5 000 r/min,离心10 s。保留沉淀用裂解缓冲B液104 L重悬,冰浴2 min。0 ,12 000 g,离心15 min。保留上清液,取1 L用考马斯亮蓝染色法测定核蛋白浓度。其余上清液分装,-70 保存备用。凝胶迁移率变动电泳分析法具体步骤 参考文献 1
10、。逆转录-聚合酶链反应检测肺组织中ICAM1 mRNA变化 总RNA的提取参照Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行。引物的设计与合成按照文献公布的Genebank上小鼠、Actin和ICAM1 cDNA序列,借助于Primer Premier 生物设计它们各自特异的引物,委托上海博亚生物技术有限公司合成。内参照Actin 扩增片段长度701 bp:正义:5gccaaccgtgaaaagatga3,反义: 5gccaggatagagccaccaat3。ICAM1 扩增片段长度433 bp:正义:5aacgacgcttcttttgctc3,反义:5ctctggcgg taatagg
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