人α防御素的稳定表达和活性鉴定.docx
《人α防御素的稳定表达和活性鉴定.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《人α防御素的稳定表达和活性鉴定.docx(13页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、人防御素的稳定表达和活性鉴定【摘要】 目的: 制备有较高生物学活性的分泌型人防御素1与防御素3,并初步鉴定其抗菌活性;方法: 将真核表达质粒pcDNA31/V5HisTOPOHNP1,3与含有dhfr基因的质粒pDCH1P11共转染入CHOdhfr,ELISA检测到培养上清中重组蛋白的表达,对阳性表达的细胞进行G418筛选,对其中9个表达量较高的阳性克隆进行氨甲喋呤加压扩增, ELISA法、RTPCR法及间接免疫荧光分析蛋白表达情况,并同步测定其体外抗菌活性.结果: 防御素1的表达量是18854746 mg/L48 h106个细胞; 防御素3的表达量是16893557 mg/L48h106 个
2、细胞.用RTPCR从稳定表达的细胞株中扩增出全长约303 bp的片段;IFA 显示稳定转染的细胞胞质核周质中有强的绿色荧光;KB纸片琼脂扩散法显示防御素1,3在大肠埃希菌MH平板上形成了明显的抑菌圈.结论: 成功高效地表达了分泌型的防御素1,3,并具有良好的生物学活性,为进一步探讨防御素1,3对HIV1的抑制作用提供了物质基础.【关键词】 人防御素;CHOdhfr细胞;甲氨喋呤0引言防御素是在中性粒细胞和上皮细胞中发现的一族富含半胱氨酸残基的阳离子短肽.根据6个半胱氨酸残基的位置及二硫键连接的不同,将哺乳动物的防御素分为3类: 防御素、防御素和环状防御素,它们具有强大而广谱的抗菌活性.人中性粒
3、细胞中含有的防御素又名人中性粒细胞多肽14等,它们在中性粒细胞分化成熟前已合成,在生理情况下不能被诱导表达1.晚近又发现: 人防御素13有抗HIV的作用2,3.然而,人体中的防御素含量很少、结构相似,通过分离提纯获得生物活性较高的防御素单组分还存在一定的技术难度,化学合成又成本太高.基因工程技术可以帮助人类获得特定的大量人类蛋白质,是获取目的蛋白的一个有效手段.因此,本课题将真核表达载体pcDNA31/V5HisTOPO HNP1,3在CHOdhfr系统中进行基因扩增表达,获得了大量分泌型的防御素,为基因工程生产防御素提供了可能的生产模式,也为进一步研究人防御素1-3与HIV1的作用环节奠定了
4、基础.1材料和方法11材料CHOdhfr由军事医学院基础研究所沈倍奋教授惠赠;真核表达质粒pcDNA31/V5HisTOPOHNP1,3由本室构建;大肠埃希菌标准质控菌株为ATCC25922;含dhfr 基因片段的质粒pDCH1P11由美国哥伦比亚大学Larry Chasin教授惠赠.Superscript TM、lipofectamine2000购自Invitrogen公司,不含HT的CHO专用无血清培养基CHOSSFM购自Gibco公司,非必须氨基酸为Hyclone公司;MTX、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、左氟沙星为Sigma公司;防御素1,3 ELISA kit、防御素1,3鼠抗人单克隆抗体为荷
5、兰HyCult 公司.异硫氰酸盐荧光素标记的羊抗鼠IgG 购自北京中山试剂公司.上下游引物由上海生工公司合成: P15 AAAGGATCC ATGAGGACCCTCGCCATC3;P25 AAAGAATTCTCAGCAGCAGAATGCCCAG3,分别含有BamH和EcoR酶切位点.其扩增产物均为303 bp.12方法121pcDNA31/V5HisTOPOHNP1,3与pDCH1P11的共转染用含100 mL/L胎牛血清、1NAA、1HT的DMEM培养基培养CHOdhfr细胞.24孔板中进行转染,转染之日细胞达到95%的融合,更换为无抗生素、无血清的CHOSSFM500 L/孔;按照LF20
6、00说明书进行转染操作.转染6 h后换含100 mL/L FBS的CHOSSFM1 mL,继续培养48 h,ELISA鉴定阳性转染的细胞按110传代,24 h细胞贴壁后换含选择性培养基.1416 d后有阳性克隆形成;因培养基中不含HT,故存活细胞为成功共转染的细胞.转染pcDNA31/V5HisTOPO HNP1/ HNP3后分别得到15个、24个阳性细胞克隆.用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板、又传代至12孔板,经ELISA测定对其中9株高表达的细胞克隆进行扩大培养.122MTX诱导防御素1,3的高效表达取2104 个细胞接种于6孔板,更换510-8 mol/L的MTX加压培养,可见大部
7、分细胞逐渐死亡,待存活细胞长至约全部融合时,测定重组蛋白分泌量;同样方法进行MTX为510-7 mol/L的加压扩增;对最高表达量的细胞株传代5次后用CHOSSFM 收液.123防御素1,3表达情况的测定1231蛋白表达水平的ELISA检测对G418筛选后的9个高效表达细胞株的培养上清及经MTX加压后的细胞上清用ELISA法测定蛋白含量,按防御素1,3 ELISA kit 说明书进行操作.计算每组各3复孔的平均值,所有数据均用xs表示.1232阳性克隆株的RTPCR鉴定收集加压筛选后的细胞,用Trizol进行总RNA提取, Superscript TM 反转录试剂盒合成cDNA, P1/P2为
8、引物进行PCR反应,反应体系为95预变性 5 min后扩增,即95变性30 s,52退火30 s,72延伸 30 s,35个循环,72终延伸10 min.1233IFA测定稳定转染的细胞经爬片、固定、洗涤后,分别滴加1300稀释的防御素1和3单抗,37湿育1 h;同法漂洗,滴加150稀释的FIFC标记的二抗,最后于荧光显微镜下观察.空质粒pcDNA31(+)转染的CHOdhfr 为阴性对照.124抗菌活性试验无菌条件下收集最高表达细胞株的无血清细胞培养上清,经过滤、冷冻干燥浓缩及重溶后,ELISA测定母液浓度,配制不同浓度的稀释液进行后续试验.根据Lehrer 等的方法4,并借鉴KB纸片琼脂扩
9、散法5.将灭菌滤纸片放入浓度为A: 15 mg/L;B: 75 mg/L;C: 38 mg/L;D: 19 mg/L的稀释液和E: 阴性对照中浸泡12 h,室温阴干,阳性对照为1 g/L的LEFX.在接种05麦氏比浊大肠埃希菌菌液的MH平板上贴紧已浸泡过的纸片,35孵育1618 h后,量取抑菌圈直径.2结果21ELISA检测防御素1,3的表达经MTX扩增后,外源蛋白的表达量出现了大幅度的提高,防御素1中最高一株的表达量扩增了近200倍,防御素3中最高一株的表达量扩增了100倍.图1RTPCR法检测pcDNA31/V5HisT0P0HNP1、/V5HisT0P0HNP3稳定转染的细胞株略表1EL
10、ISA检测防御素1,3的表达略22RTPCR法检测防御素1 mRNA与防御素3 mRNA的表达稳定转染的细胞株中扩增出303 bp大小的片段,而阴性对照组无相应条带.23在稳定转染的细胞,可见明显的绿色荧光弥漫分布于细胞胞质核周质中,提示目的蛋白表达于内质网腔.在有的细胞,位于核一侧的荧光尤为明亮,为典型的分泌型表达模式.空质粒转染的阴性对照组仅见伊文氏蓝衬染的红色细胞核.24抗菌活性测试在防御素1测试平板: 阳性对照组可见直径为29 mm的抑菌圈;阴性对照组仅见 6 mm的抑菌圈,其余不同浓度的防御素1上清分别可见直径为26,22,22,18 mm的抑菌圈;在防御素3测试平板: 阳性对照组可
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 防御 稳定 表达 活性 鉴定
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【丰****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【丰****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。