PMA联合钙离子载体诱导K562细胞向树突状细胞分化.docx
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1、PMA联合钙离子载体诱导K562细胞向树突状细胞分化【摘要】 目的 探讨卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯联合钙离子载体诱导K562细胞向树突状细胞分化的作用。方法 对数生长期的K562细胞在含PMA和CI的培养液中培养96 h后,倒置相差显微镜下观察细胞形态,用流式细胞仪检测细胞表型,用MTT法检测其刺激淋巴细胞增殖的能力。 结果 PMA联合CI组细胞形态发生明显变化,表面出现许多细小的突起,细胞表面CD83、CD86、CD80、CD40、HLADR和CD1a表达上调,并且可以刺激淋巴细胞的增殖反应。 结论 PMA联合CI可以有效地使K562细胞向DC分化。【关键词】 K562细胞 树突细胞 十四酰佛波乙
2、酯 钙通道 离子载体 ABSTRACT: Objective To explore the effect of PMA (phorbol myristate acetate) and calcium ionophore (CI) in inducing the differentiation of leukemia cell line K562 into activated dendritic cells (DC). Methods K562 cells were cultured in a common medium containing CI (A23187) and PMA for 96
3、 h. The cell morphology was observed under the light phase contrast microscope and the electronic microscope. The viability rate of K562 cells cultured in each group was examined by the trypan blue staining. The immunologic phenotypes were analyzed by flow cytometry. The proliferation reaction of ly
4、mphocyte cells was detected by MTT colorimetry. Results After 96 h treatment with A23187 (375ug/ml) and PMA (10 g/mL), the cells exhibited the characteristic DC morphology, CD83, CD86, CD80, CD40 and HLADR, CD1a expression was upregulated and the cells were found to be able to strongly stimulate the
5、 proliferation of allogeneic T cells when cultured with them. Conclusion CI in combination with PMA can induce K562 cells to differentiate into DCs. KEY WORDS: K562 cells; dendritic cells; tetradecanoylphorbol acetate; calcium channels; ionophores 福建医科大学学报 2008年7月 第42卷第4期曾晓明等:PMA联合钙离子载体诱导K562细胞向树突状细
6、胞分化树突状细胞是体内最强的抗原提呈细胞,来源于髓系祖细胞。在白血病的细胞中,DC的祖细胞和白血病细胞同样来源于骨髓造血干细胞,因此可以刺激原始细胞分化成DC,直接呈递完整的白血病抗原,从而刺激T细胞产生抗肿瘤效应 1。笔者观察了卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol myristate acetate,PMA)联合钙离子载体诱导K562细胞向DC分化的作用,探讨运用细胞株进行抗白血病免疫治疗的可行性。 1 材料与方法材料K562细胞株由福建医科大学药理学研究所馈赠。CI、PMA为Sigma公司产品。RPMI 1640干粉为美国Gibco公司产品。胎牛血清(FCS)为杭州四季青生物制品公司产品。
7、异硫氰酸荧光素标记的抗HLADR、CD80单抗,PE标记的抗CD86,CD83,CD40和CD1a单抗及同亚型对照抗体,均为美国eBioscience公司产品。丝裂霉素C为上海Roche公司产品。6孔培养板、96孔培养板均为Coasta公司产品。L谷氨酰胺、MTT及台盼蓝制剂为厦门泰京生物工程有限公司产品,人淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品。方法K562细胞培养及形态观察取对数生长期的K562细胞,以完全RPMI 1640培养基悬浮,以1106 mL-1接种于6孔板中,每孔2 mL,分4组。PMA+CI组:加入PMA和CI,使PMA最终浓度为10 ng/mL,CI最终浓度
8、为 375 ng/mL;PMA组:只加入PMA,PMA最终浓度为 10 ng/mL;CI组:只加入CI,CI最终浓度为375 ng/mL;对照组:只加培养基。每组细胞为一板,37 、体积分数为的CO2培养箱中培养,隔天半液换量。实验组另外加入半量新鲜试剂,对照组只补充新鲜培养基。培养96 h后收获细胞。形态观察。收获4组细胞,在倒置显微镜下观察细胞形态。细胞活率测定。收获各实验组的K562细胞,按台盼蓝1滴、K562细胞9滴的比例混合均匀,30 s滴于细胞计数板上,显微镜下计数。 计算细胞活率=不染色细胞/100 电镜观察收获的细胞经离心沉淀,用%戊二醛和%饿酸固定,经乙醇梯度脱水,超薄切片置
9、透射电镜观察。流式细胞仪检测收获的细胞用PBS洗涤2次后重悬成体积100 L,加入FITC标记的抗HLADR和CD80单抗,PE标记的抗CD86、CD83,CD40和CD1a单抗及同亚型对照抗体20 L,室温孵育30 min,PBS洗涤3次,用流式细胞仪检测。同种混合淋巴细胞反应人外周血淋巴细胞的分离和培养抽取健康人外周血20 mL,用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离,吸取中间层单个核细胞层,洗涤3次,用1640完全培养基重悬浮,于6孔板37 、体积分数为的CO2培养4 h后,轻轻吸取未贴壁细胞,为外周血淋巴细胞,备用。MTT比色法测定取PMA+CI组培养96 h后收获的K562细胞,用PBS洗
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