细胞分子生物学技术样本.doc

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1普通细胞化学与酶细胞化学区别与联系
细胞化学是研究细胞的化学成分, 在不破坏细胞形态结构的状况下, 用生化的和物理的技术对各种组分做定量的分析, 研究其动态变化, 了解细胞代谢过程中各种细胞组分的作用, 是在细胞活动中的变化和定位的学科。
细胞化学是研究细胞的化学成分, 及其在细胞活动中的变化和定位的学科。即在不破坏细胞形态结构的状况下, 用生化的和物理的技术对各种组分做定量的分析, 研究其动态变化, 了解细胞代谢过程中各种细胞组分的作用。
细胞化学对酶的研究一般是将薄的冰冻切片用适宜的底物温育, 然后来测定酶在细胞内的位置
酶细胞化学技术:
将细胞内的酶与底物相互作用, 再将酶反应的产物作为反应物质, 在酶的作用部位进行捕捉, 使其在显微镜下具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物, 经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞化学反应。
酶细胞化学反应实际上就是孵育反应的过程, 孵育液的成分主要有酶的底物、 捕捉剂, 保证孵育液pH的缓冲液以及有关的添加剂等。孵育的温度和时间可根据不同的酶和组织经过实验而确定。电镜酶细胞化学的样品在孵育反应后需经锇酸后固定、 梯度乙醇脱水、 环氧树脂包埋和超薄切片, 至电镜下观察。
基本实验过程
光镜样品: 固定( 酶固定+结构固定) → 冷冻切片 → 细胞化学反应
( 酶反应+捕捉反应) → 光镜观察
电镜样品: 固定( 酶固定+结构固定) →切组织片→细胞化学反应
( 酶反应+捕捉反应) →脱水包埋→ 超薄切片→电镜观察
2.为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养
细胞分化程度低, 增殖能力强, 更易于培养
3、 如何实现一个人的基因在e.coli中的表示 简述其实验步骤  
利用含有携带外源目的基因表示载体的E.coli表示菌株, 经过向细菌培养基中加入化学试剂或是经过温度等条件的诱导( 根据所构建的表示载体确定, 不同载体构建中所用启动子不同, 诱导表示方式也不一定相同) , 可使外源基因在E.coli中高效表示。
首先提取你要的目标的mRNA, 然后做反转录PCR, 设计引物的时候注意上游引物要包含启动子和下游引物要包含终止子, 这样才能获得完整的编码序列。
然后你需要将你的反转录PCR产物进行序列测定, 当然如果你这个是已知序列则能够不去测序, 但你必须保证你有这个基因的完整开放可读框序列信息。接着, 选择载体和宿主菌。你需要分析你要表示的基因的序列中含有哪些酶切位点和载体上的多克隆位点。然后, 选择个内切酶, 内切酶选择的要求有两个, 一要是载体上多克隆位点有酶切位点的, 二是你的序列中没有这两个酶的酶切位点。接着, 就是人工在你的序列末端添加这两个酶的酶切位点, 你需要重新设计引物, 在原来第一次设计的引物基础上分别在上下游引物前面带上这两个酶切位点序列( 上游一个, 下游一个, 不能随便加, 你要查看多克隆位点的酶的排列顺序, 上游引物前面加排在前面的酶切位点, 下游引物加后面的) 。加上酶切位点后还要在前面加上保护碱基, 以确保内切酶能够完整的切出片段的酶切位点, 保护碱基序列能够去查询相关内切酶的资料。接着用设计好的第二次引物使用第一次RT－PCR产物作为模板进行PCR扩增。得到的产物纯化后用选择的酶进行双酶切, 同时也要对载体DNA用同样的两种内切酶进行双酶切。酶切结束后, 分别纯化载体片段和PCR产物片段, 然后进行连接。此时能够制作感受态细胞, 连接结束后开始做转化。经过PCR筛选和双酶切鉴定得到阳性的菌株后, 就能够进行液体培养诱导表示了。PET系统基本上都是用IPTG作为诱导物的, 将阳性克隆接到含有相应抗性的液体LB培养基中37度培养3小时, 然后加入0.1～1.0mM终浓度的IPTG, 再培养4小时左右一般你就能拿到表示产物了。
真核基因在E.coli中表示实验步骤: ①引物设计②目的基因总DNA提取③目的基因的PCR扩增④目的基因连接到克隆载体⑤重组质粒的酶切鉴定与序列分析⑥目的基因连接到表示载体⑦转化到E.colicen中表示⑧表示产物的免疫性分析
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基因组DNA提取和质粒DNA提取的异同点及注意事项
基因组DNA提取步骤
1. 从无水乙醇中取出少许组织( 约50mg) 加入干净灭菌的EP管中,
剪碎;
2. 加入400ul 1％的SDS, 8ul( 20mg/ml) 的蛋白酶K, 充分浸润,
入55℃摇床( 100转/分) , 期间振荡助溶至澄清( 5-6h) ;
3. 取出消化液, 加入6mol/L的NaCl300ul, 氯仿200ul, 轻柔正反
颠倒, 使其充分乳化, 4℃13000转/分离心30min;
4. 取出上清( 约400ul) , 加入等体积氯仿抽提一次, 轻柔颠倒后,
4℃13000转/分离心10min;
质粒DNA提取一般用沸水浴法和碱裂解法, 现在一般都采用碱裂解法, 并有试剂盒可用, 它主要是将细胞内的环状质粒提取出来, 一般需要用SDS裂解, RNA酶降解, 然后过柱, 再进行洗脱。过程比较简单。
而基因组DNA提取则较为复杂, 也需要用SDS裂解和RND酶降解, 但降解时间较长, 同时对有些革兰氏阳性细菌还要进行溶菌酶处理, 最后用氯仿-苯酚进行除蛋白, 这一步重复进行多次, 在用氯仿除去多余的苯酚, 用乙醇清洗烘干后溶于TE缓冲液中, 整个过程比提质粒更复杂, 耗时也更多。
5. 上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、 分析一
般无影响, 可省略该步骤) 。
6. 取上清加入等体积异丙醇, 轻柔混匀后-20℃沉淀10min;
7. 4℃13000转/分离心15min, 弃上清;
8. 用75％乙醇洗涤1-2次( 1000ul, 11000转/分离心2min) , 弃上
清;
9. 冰冻无水乙醇洗涤1-2次( 1000ul, 11000转/分离心4min) 弃上
清, 自然晾干或烘干, DDW溶解, 30-50ul。
基因组DNA的提取一般见于构建基因组文库、 Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,能够将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,
质粒抽提流程详解——沉淀菌体
检查细菌培养情况, 将明显浑浊的菌液倒在已经编号的2ml的沉菌用离心管里, 在约1 转/min的速度下离心沉淀1分钟, 保证无悬浮物后取出; 将离心管倒扣在卫生纸上, 用力敲击, 至液体培养基完全去除; 如发现菌体沉淀的少, 可多加2ml菌液重复沉菌一次。
在离心管中加入250µl 加过RNaseA1酶的Buffer S1, 用振荡器震荡, 直到沉淀完全充分悬浮。
质粒抽提流程详解——裂解
在离心管中加入250µl Buffer S2, 上下缓慢颠倒7~8次至混旋液澄清( 这步的操作时间不得超过4分钟) ;
☆ 注意: 颠倒时不能太剧烈, 否则会有核DNA污染; 如果Buffer S2因温度过低有SDS沉淀析出, 可将其放置55~60C水溶锅中适当加热至澄清后再用。
质粒抽提流程详解——中和
加入400ul Buffer S3, 剧烈颠倒5~10次, 使之充分中和, 同时将大块白色沉淀振成小块, 便于离心。
在约13600转/min的速度下离心沉淀12分钟, 如有因沉淀不完全引起的白色絮状物质, 可重复振荡离心直至沉淀完全。
质粒抽提流程详解——纯化
将上步离心上清液用移液器转移到吸附柱上, 在约10500转/min的速度下离心1分钟。
注意: 不要把沉淀物转移到吸附柱里, 1个样品使用1个枪头。
质粒抽提流程详解——洗涤脱盐
取出DNA吸附柱, 弃掉废液收集管中的液体, 将柱子放回这个离心管中, 加入500ul Wash Solution到柱子中, 高速离心( 10,000rpm)30秒。
重复上述步骤一次。
取出DNA吸附柱, 弃掉废液收集管中的液体, 将柱子放回这个离心管中, 最大速度离心2分钟
使用Wash Solution要进行两次洗涤, 目的是使残留的蛋白、 盐离子等杂质更充分的被去除, 保证硅胶膜上吸附的DNA尽量纯。

质粒抽提流程详解——产物回收
将DNA吸附柱移入新的1.5ml离心管中, 在DNA吸附柱的膜中央加入30-40ul 预热无菌双蒸水, 室温放置2分钟后12, 000rpm离心1分钟, 离心管底即为质粒DNA。
一些RNA提取方法, 在进行具体实验时, 应根据研究对象的性质, 提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。
1、 在核酸提取时, 为了增加细胞的裂解度, 增加核蛋白复合体破碎度, 以释放更多的游离核酸, 在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K, 在确保没有核酸水解酶存在的前提下, 酶反应时间越长越好。
2、 有时在使用蛋白酶时, 为了抑制核酸水解酶的降解作用, 可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL, 而且可将反应温度提高到50－60℃, 并将反应时间缩短到15－25min, 但酶用量必须提高10－20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA, 因游离金属离子对酶有抑制。
3、 许多植物材料中富含酚, 在细胞破碎时, 在多酚氧化酶作用下, 被氧化成有色的锟类物资, 影响核酸的提取及降低提取质量, 在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体, 在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
4、 许多生物材料在提取核酸时, 都会遇到多糖的污染问题, 具体表现为有机溶剂沉淀时, 沉淀很多, 但复溶时, 大量沉淀不溶, 电泳观察时核酸含量很低
用无水乙醇沉淀DNA
在用乙醇沉淀DNA时, 一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L
裂解法小量制备质粒DNA重复性好, 一般无麻烦。若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割, 可经过酚氯仿再次抽提, 以清除杂质来解决问题
DNA
1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。
2、 酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性, 飞溅到皮肤、 粘膜和眼睛会造成损伤, 因此应注意防护。氯仿易燃、 易爆、 易挥发, 具有神经毒作用, 操作时应注意防护。5 m: d! o8 g% {3 ^* \
3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。
4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。
5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要经过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
8、 用大口滴管或吸头操作, 以尽量减少打断DNA的可能性。* @0 K2 `* m7 S
9、 要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样经过降低内切酶的活性DNA的降解。/ I1 U6 y5 m$ F' h! W8 f' b
10、 避免剧烈吸打DNA, 不能搅动基因组DNA。4 P9 o1 q( F   j, A7 Z' {4 k+ f
11、 吸取基因组DNA时, 要用专用的粗口吸头, 普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。% c# `% F+ R* A2 Z- g
12、 基因组应4度保存, 如-20度保存可能导致DNA断裂。. C3 n* p6 ]& a7 T& G7 Z# \
13、 在准备实验的过程中, 应将DNA样品放在碎冰上。! |: A4 s0 ?, l: _: W1 D- g* D
14、 用Tris缓冲液溶解DNA。5 O; i" O. q" [
15、 加缓冲液后, 为了加速DNA溶解, 能够轻轻晃动或轻弹试管。
16、 加入缓冲液后, 置于4度过夜, 也能够溶解DNA。7 }& {2 m( P1 W. y
17、 将DNA溶液65度温育10分钟, 能够灭活DNase。
18、 在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚, 说明其中蛋白质含量较高, 可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。& w# d( o" C9 R# m9 F
19、 酚抽提时如果上清液太粘稠, 无法进行水相转移时, 可加入适量TES稀释后再抽提