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DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析
【摘要】　目的对DNA分子遗传标记技术在中药材鉴定领域的作一综述。方法通过查阅20世纪90年代以来的 文献 进行归纳分析。结果DNA分子遗传标记技术具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低的特点；使用较多的方法主要有RAPD、ISSR、ITS标记以及rRNA基因序列分析技术。同时，DNA分子标记技术也存在着使用局限、对实验硬件和从业人员的技术要求高、成本较高、技术复杂度高、对不同部位入药的药材仍然难以区分以及无法用于成药、复方、提取液鉴定等弱点。结论DNA分子遗传标记作为中药材鉴定的方法还有待　和完善。
【关键词】　DNA分子遗传标记； 中药材； 鉴定
　　Abstract：ObjectiveThe paper summarizes the researches of application of DNA molecular markers in Chinese medicinal　and analysis were used by referring to literature released since 1990s . ResultsDNA Marker Technologies have characteristics of trace,rapid,peculiarity, accuracy and credibility, lower requirements for the sample. Random amplified polymorphic DNA (RAPD),inter-simple sequence repeat (ISSR), interial transcribed spaoers (ITS) and rRNA gene sequencing technology are often , DNA Marker Technologies have some disadvantages that employees are required special skills,the cost is high and the technique is complicated,while it is difficult to distinguish different parts of Chinese medicinal materia used medicinally and identify patent medicine, Chinese medicine complex prescription and the extract of Chinese medicinal materia. ConclusionThe methods of Chinese medicinal materia identification by DNA molecular markers need to develop and improve.
　　Key words：DNA molecular marker； Chinese medicinal materials； Identification

　　针对我国药材种类繁多,来源复杂且品种混淆情况严重的状况, 为了保证用药的安全及质量和疗效,广大中医药领域的专家学者多年来一直都致力于寻找更加 科学 的鉴定方法来解决这一难题。随着当今生命科学不断取得重大突破, 其中分子生物学技术以其准确性高、重复性好等特点尤为引人瞩目。DNA分子标记大致可分3类:首先是以电泳技术和分子杂交技术为的分子标记技术,其中代表技术有RFLP分子标记技术；第2类是以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记技术,实际使用较多的代表技术为:RAPD、简单序列重复间区标记技术(inter-simple sequence repeat ISSR)和AFLP(Amplified restriction fragment Polymorphism)。第3类是以DNA序列为核心的分子标记技术,其代表性技术有ITS(interial transcribed spaoers)测序分析技术。本文仅就最近十几年来DNA分子标记技术在中药鉴定方面的应用作一分析， 并就其应用前景进行讨论和展望。
　　1 经典的DNA分子标记技术

　　此类技术的代表是限制性片断长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)。
　　RFLP是最早发展的分子标记，是由Bostn首先提出，Soller和Beckman最先应用于品种鉴别和品系纯度的测定，这是最早发展的分子标记技术。其基本原理是利用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后，与同位素或非同位素探针标记杂交，从而显示与探针含同源顺序的酶切片段在长度上的差异。RFLP探针的来源主要是RG克隆和cDNA克隆，其中cDNA探针保守性较强，许多同科物种cDNA探针都可以作为通用探针。在实际应用过程中，人们普遍感到经典的RFLP技术须经酶切、电泳、Southern转移、与探针杂交、放射自显影等步骤, 在实际应用中很不方便，费时费力,并受到探针来源的限制，多态性检出效率低(只能检测探针长度内切酶识别位点上的变异)。同时要求的DNA量较大,实验材料必须新鲜, 因此难以适用于干燥药材的鉴定,目前在中药鉴定领域已很少使用,已归为被淘汰的技术。
　　在多源性中药材如伞形科北沙参、柴胡,菊科苍术属豆科甘草属,羽扇豆属，Yamazaki M,茄科澳茄属(Duborsia s ) Mizukami H,3种苍术Mizukami H的基原鉴定、资源分析及其地理品系(居群)间亲缘关系研究方面有了一些报道。
　　2 基于PCR的DNA分子标记技术

　　此类标记技术的代表为:RAPD技术又称为锚定简单序列重复技术由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年提出。它用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2～4个随机核苷酸，在PCR中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增interSSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表。ISSR标记技术特点：实验操作简单、快速、高效，不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤。ISSR标记技术结合了RAPD标记技术和SSR标记技术的优点，耗资少，模板DNA用量也少。
　　2003年以来，此标记技术受到许多学者的青睐，邱英雄等［20～31］分别对明党参和川明参、南北五味子、罗汉果、金花茶、怀区地黄、铁皮石斛和黄精、麦冬、金钗石斛、丹参和半夏等药材的基因组DNA进行PCR扩增，建立并优化了ISSR-PCR反应体系，结果证明ISSR标记可以作为不同产地药材鉴别的有效分子标记。
　　此外，2008年以来，李磊等［32～36］分别对4种叶型性状半夏和掌叶半夏、山茱萸、银杏、益智和乌头等药材利用ISSR分子标记进行了分析，并取得良好结果。
　　DNA序列分析技术以DNA序列为核心的分子标记技术。建立在PCR技术基础之上的DNA测序分析技术(DNA sequencing)的开发使DNA分子标记技术取得了又一次的突破性进展。
　　动植物在进化过程中，其基因会发生碱基的重排、替代等，从而导致基因序列的差异。通过检测其DNA片段序列的差异，即可将不同的种区别开来。近年来，由于DNA测序技术的发展以及人们对一些基因结构、功能的进化 规律 认识的更加深入，一些基因已用于动植物的进化与分类、物种鉴别研究。利用已知基因的结构、序列，可以为PCR引物的设计及目的基因的扩增提供前提条件。而基于PCR的DNA直接测序技术，极大地提高了DNA序列分析的效率，促进了该项技术的应用研究。目前用于中药DNA测序的基因主要有植物叶绿体基因组的rbcL，mat K rpoC 等；植物核基因组的rRNA、ITS等；动物线粒体基因组Cytb基因等 ，这些被选基因的共同特点是进化速率差异大，基因序列变异大，基因序列均匀地分布于整个基因组，分辨率高，一般用于种级以上的分类系统研究以及分析研究动植物的亲缘关系与进化等。
　　马小军等［37～40］2005年分别通过测定山参、大戟、巴戟天以及细辛和柴胡的序列，获得了可喜的效果 。
　　此外，徐红等［41～47］2004年分别对川芎、西洋参、竹节参、石斛、姜黄、大黄、当归及小秦艽、肉苁蓉、广藿香、太子参、葛根等进行了药材鉴别，根据序列能够将研究对象区别开。
　　动物类药材多用线粒体细胞色素b基因片段的序列变异鉴别药材。1998年吴平［48］通过分析对乌龟、中华鳖和山瑞鳖线粒体12S rRNA基因片段序列来区分正品和混淆品；还通过扩增约450bp的12S rRNA和约490 bp的Cytb基因片段对海马作了DNA序列分析，可作为其它动物药材干样品鉴定的 参考 。1999年王义权等［49］扩增了乌梢蛇及其混淆品的Cytb基因片段，通过比较蛇的Cytb基因246 bp的同源DNA序列，可以准确区分乌梢蛇及其混淆品。
　　3 评价与展望
　　评价中药材品质鉴定是中药质量控制的首要环节，多年来人们一直在寻找科学有效的鉴定中药材的方法，从应用的现状不难看出DNA分子标记技术在该领域的应用已经取得了一些成绩。DNA分子标记技术作为中药材品质鉴定方法之一具有以下几点优势：微量、快速、特异性强、准确可靠，且不受药材生长发育阶段、供试部位、条件、产地、采收季节、贮藏等因素的影响，对样本要求较低，无论是药材还是成药、甚至是粉末都可以用来鉴别；归纳起来DNA分子标记技术已应用于几个方面：①用于中药真伪、近缘药材及代用品鉴别，使用的方法主要有RFLP，RAPD，AP-PCR，ITS等标记；②药材的野生类型与栽培品种的研究，使用的方法主要有RAPD，AFLP；③粉末、中成药鉴别，使用的方法主要有RAPD，RT-PCR；④本草考证与出土中药研究，使用的方法主要是测序技术；⑤道地药材研究，使用的方法主要有RAPD，RFLP ，AFLP标记和ITS与rRNA基因序列分析技术。文献报道的研究人员主要集中在 中国 、日本，但已显示了强劲的发展势头。另一方面，DNA分子标记技术在中药材鉴定中的应用也存在着明显的不足。主要表现在几个方面：①作为鉴别药材的方的研究，投入的人力物力都还很有限，与中药其他方面研究的结合还未开展，所以从方法学上来讲，中药材的分子鉴定方法还需要发展才是。②使用还很局限，由于分子标记技术对实验室硬件和从业人员的技术要求很高，再加上成本也较高，所以真正用于中药材鉴别的方法还很少，已涉及的中药品种也很有限，从文中可看出，仅RAPD、ISSR以及测序技术使用较多，涉及的中药品种也只有几十种；正因为技术复杂度的制约，此类鉴别技术对于生产收购第一线的人员仍然显得复杂，还无法推广使用。③数据分析所使用的还很局限，测序后对数据进行分析，这是判断药物近缘关系的关键步骤，数据分析必须借助多种软件及适当的方法，以往多采用的N(1972)方法现已显单一了，目前用于其他生物技术的分析软件早已多元化了,且很多新的软件主要应用于中药材的遗传多样性分析当中。④DNA分子标记技术对不同部位入药的药材仍然难以区分，各部具有同样DNA标记式样。对于成药、复方、提取液的DNA标记还未见报道。
　　展望从分子标记技术的　来看，前后也就二十多年的时间，它也是随着分子生物学技术及信息技术的发展而发展的，不可否认的是分子标记技术肯定是本世纪的主流技术。除了以上分子标记技术外，现在还发展有单核苷酸多态性标记技术、相关序列扩增多态性标记技术、靶位区域扩增多态性标记技术、荧光原位杂交技术、变性梯度凝胶电泳技术等［50］，这些技术已被用于其它一些领域的研究之中，因此，作为方的研究，在中药鉴定领域还应该加大人力物力的投入，选择和发展出更适合中药鉴定或针对不同鉴定对象的鉴定方法，最终推动分子生物学技术对更多的中药品种或剂型进行鉴定。同时我们也看到，仅仅依靠分子标记技术在相当长的时期内还不可能解决中药材和中药制剂的鉴定和质量控制，那么我们就还必须要同时选择多种方法进行协同分析，比如分子标记技术与细胞学标记技术、生化标记技术、高效液相及核磁共振分析等技术的协同使用，通过多种技术的结合来达到最终准确鉴定中药材或中药复方制剂的目的。
【 参考　文献 】
　　［1］黄璐琦,王 敏，周长征，等.RAPD方法在细辛类药材鉴别研究中的问题及对策［J］.药学学报，1998，33(10)：778.
　　［2］黄璐琦，王 敏，杨 滨，等．用随机扩增多态DNA(RAPD)技术鉴别中药天花粉及其类似品［J］．药物生物技术,1999，19(4)：233.
　　［3］王培训，黄 丰，周 联,等．商品西洋参DNA指纹谱鉴别［J］．中药新药与药理，1999，10(6)：367.
　　［4］于燕莉，向凤宁，夏光敏，等．DNA序列分析在金银花品种鉴定中的［J］.山东 科学 ，2000，13(4)：39.
　　［5］肖小河，刘峰群，史成和,等．国产姜黄属药用植物RAPD分析及分类鉴定［J］．中草药，2000，31(3)：209.
　　［6］Lay H，Liu H，Liao M，et a1．Genetic identification of Chinese drug materials in Yams(Dioscorea spp)by RAPD analysis［J］．Food Drug Anal，2001，9(3)：132.
　　［7］黄芸，秦民坚，杨 光，等．RAPD法鉴定射干类中药［J］．中草药，2002，33(10)：935.
　　［8］胡珊梅,张启国,周涵韬，等．RAPD法在金线莲的鉴别研究中的应用［J］．中草药，2002，33(10)：949.
　　［9］党荣理，马永红，吴 霞，等．新疆产麻黄的RAPD分析［J］．中草药，2003，34(9)：861.
　　［10］Zhao M ，Chen M ，Wang N，et a1．Study on genetic relation-ship among some commercial strainsofGanoderma［J］．J Na ingAgricultural University，2003，26(3)：60.
　　［11］刘文生，朱建明，何 斌,等．中药材厚朴的随机扩增多态性DNA指纹图谱 研究［J］．中药材，2004，27(3)：164．
　　［12］周延清，景建洲，李振勇，等．利用RAPD和ISSR分子标记分析地黄种质遗传多样性［J］．遗传，2004，26(6)：922.
　　［13］罗 恒，王和勇，孙 敏，等．应用RAPD快速鉴别中药材海风藤及其替代品［J］．中医药学报，2004，32(5)：33.
　　［14］李 颖，李劲平．广藿香道地性的RAPD研究［J］．　医药卫生,2006，22(13):2027.
　　［15］马小军，汪小全，肖培根，等.人参农家品种的AFLP指纹研究［J］. 中国 中药杂志,2000，25(12)：707.
　　［16］罗志勇，周 钢，周肆倩，等．AFLP法构建人参、西洋参基因组DNA指纹图谱［J］．药学学报，2000，35(8)：626.
　　［17］虞 泓，和 锐，倪念春,等.石斛属4种植物的AFLP分析［J］．中草药，2004，35(7)：808.
　　［18］谢 渊,张小蕾,李 毅,等.天麻AFLP分析技术体系的建立［J］.生物技术，2007，17：47.
　　［19］常楚瑞，邹佳宁,宋聚先,等.天麻扩增酶切片段长度多态性反应体系的建立［J］.贵阳院学报,2006，31:391.
　　［20］邱英雄，傅承新,吴斐捷.明党参与川明参群体遗传结构及分子鉴定的ISSR分析［J］．中国中药杂志，2003，28(7)：598.
　　［21］孙 岳，李景鹏,金元昌,等．南、北五味子ISSR鉴别研究［J］．中医药学报，2003，31(1)：29.
　　［22］周俊亚，宾晓芸，彭云滔,等.罗汉果ISSR—PCR反应体系的建立［J］. 广西师范大学学报,2004,22:81.
　　［23］宾晓芸,唐绍清,周俊亚,等.金花茶遗传多样性的ISSR分析［J］.武汉植物学研究,2005，23(1)：20.
　　［24］彭云滔,唐绍清,李伯林,等.野生罗汉果遗传多样性的ISSR分析［J］.生物多样性,2005，13(1)：36.
　　［25］周延清,景建洲,李振勇,等.怀区地黄遗传多样性的ISSR鉴定［J］．中草药，2005,36(2)：257.
　　［26］沈 洁，丁小余,丁 鸽,等.铁皮石斛居群差异的研究ⅡISSR指纹标记方法的建立与优化［J］. 中国中药杂志, 2006，31：291.
　　［27］周 晔,王润玲,唐 铖,等.ISSR法鉴定中药黄精与卷叶黄精［J］.天津医科大学学报，2006，12：178.
　　［28］叶桂英,杨关全,梁国鲁,等.两种常用麦冬栽培品种的ISSR分子鉴定［J］.亚太传统医药,2007，3：48.
　　［29］魏丹红,徐 红,王燕燕，等.金钗石斛遗传多样牲研究的ISSR-PCR反应休系建立与优化［J］.上海中医药大学,2007, 2l (4): 65.
　　［30］徐 红,王燕燕,魏丹红,等.不同产地丹参药材的ISSR分析与鉴别［J］.中药新药与临床药理,2007, 18(6):454.
　　［31］张君毅,郭巧生,杭悦宇,等.半夏ISSR—PCR反应体系的建立及条件优化研究［J］.江苏科学,2007,2:154.
　　［32］李 磊,陈 敏,张 明,等.4种叶型性状半夏和掌叶半夏的ISSR分析［J］.西南师范大学学报,2008，33：86.
　　［33］关 锰,白成科,王苗之,等.正交设计优化山茱萸ISSR．PCR反应体系研究［J］.陕西师范大学学报,2008，32：80.
　　［34］曹福亮,王国霞,李广平,等.银杏ISSR-PCR扩增反应体系的优化［J］.浙江林学院学报,2008，25(2)：186.
　　［35］刘晓静,王文泉,郭凌飞,等.益智ISSR-PCR 反应体系建立与优化［J］. 生物技术,2008,18(3)：33.
　　［36］张岳峰,万里翔，徐 敏，等.乌头DNA的改良CTAB提取和ISSR检测［J］.湖北农业科学,2008，41：12.
　　［37］马小军，汪小全,肖培根，等．野山参与栽培参核糖体DNA的ITS系列比较［J］.中国中药杂志,2000，25(4)：206.
　　［38］蒋继宏，孟 娜，曹小迎,等．苏皖产大戟属药用植物rDNA的ITs序列分析［J］.中草药，2005，36(6)：900．
　　［39］丁 平，方 琴．巴戟天与常见混伪品的rDNA ITS序列分析及其分子鉴定［J］．中草药，2005，36(6)：908.
　　［40］刘春生，白根本，阎玉凝．基于核DNA ITS序列的细辛药材基源及分子鉴定研究［J］．中国中药杂志，2005，30(5)：329.
　　［41］徐 红,李晓波,丁小余,等.中药黄草石斛rDNA-ITS序列分析［J］．药学学报，2001,36(10)：777.
　　［42］姬可平，李啸红，李应东,等.应用rDNA ITS基因间隔区碱基测序对中药大黄进行鉴定［J］．世界科学技术——中药现代化,2002，4(4)：44.
　　［43］Tomari N，Ishizuka I，Moriya A，et a1．Pharmacognostical studies of Cistanchis Herba(III)．Phylogenetic relationship of the Cistanche plants based on plastid rps2 gene and rp116-rp114 intengenic spacer sequences［J］．Biol Pharm Bull,2002，68：218.
　　［44］刘玉萍，罗集鹏，冯毅凡．广霍香的基因序列与挥发性油化学型的相关性分析［J］．药学学报,2002, 37(4)：304.
　　［45］余永邦,秦民坚，粱之桃,等．不同产区太子参的rDNA ITS区序列的比较［J］．植物资源与学报，2OO3，12(4)：1.
　　［46］曾 明,马雅军,郑水庆,等.中药葛根及其近缘种的rDNA ITS序列分析［J］．中国药学杂志，2003，38(3)：173.
　　［47］金成庸，陈建伟，刘忠权,等.韩茵陈等3种药材基源rDNA内转录间隔区的序列分析鉴定［J］.中西医结合学报,2004，2(1)：58.
　　［48］吴 平,周开亚,徐璐珊,等.中药材龟甲的分子鉴定研究［J］.药学学报,1998，33(4)：304．
　　［49］王义权,周开亚，徐璐珊,等.中药材乌梢蛇及其混淆品的DNA序列分析鉴别［J］.药学学报，1999，34(1)：67．
　　［50］周延清.生物遗传标记与应用［M］.北京:化学 工业 出版社,2008：194.