DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析.docx
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1、DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析【摘要】目的对DNA分子遗传标记技术在中药材鉴定领域的作一综述。方法通过查阅20世纪90年代以来的 文献 进行归纳分析。结果DNA分子遗传标记技术具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低的特点;使用较多的方法主要有RAPD、ISSR、ITS标记以及rRNA基因序列分析技术。同时,DNA分子标记技术也存在着使用局限、对实验硬件和从业人员的技术要求高、成本较高、技术复杂度高、对不同部位入药的药材仍然难以区分以及无法用于成药、复方、提取液鉴定等弱点。结论DNA分子遗传标记作为中药材鉴定的方法还有待和完善。 【关键词】DNA分子遗传标记; 中药材
2、; 鉴定 Abstract:ObjectiveThe paper summarizes the researches of application of DNA molecular markers in Chinese medicinaland analysis were used by referring to literature released since 1990s . ResultsDNA Marker Technologies have characteristics of trace,rapid,peculiarity, accuracy and credibility, lo
3、wer requirements for the sample. Random amplified polymorphic DNA (RAPD),inter-simple sequence repeat (ISSR), interial transcribed spaoers (ITS) and rRNA gene sequencing technology are often , DNA Marker Technologies have some disadvantages that employees are required special skills,the cost is high
4、 and the technique is complicated,while it is difficult to distinguish different parts of Chinese medicinal materia used medicinally and identify patent medicine, Chinese medicine complex prescription and the extract of Chinese medicinal materia. ConclusionThe methods of Chinese medicinal materia id
5、entification by DNA molecular markers need to develop and improve.Key words:DNA molecular marker; Chinese medicinal materials; Identification针对我国药材种类繁多,来源复杂且品种混淆情况严重的状况, 为了保证用药的安全及质量和疗效,广大中医药领域的专家学者多年来一直都致力于寻找更加 科学 的鉴定方法来解决这一难题。随着当今生命科学不断取得重大突破, 其中分子生物学技术以其准确性高、重复性好等特点尤为引人瞩目。DNA分子标记大致可分3类:首先是以电泳技术和分
6、子杂交技术为的分子标记技术,其中代表技术有RFLP分子标记技术;第2类是以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记技术,实际使用较多的代表技术为:RAPD、简单序列重复间区标记技术(inter-simple sequence repeat ISSR)和AFLP(Amplified restriction fragment Polymorphism)。第3类是以DNA序列为核心的分子标记技术,其代表性技术有ITS(interial transcribed spaoers)测序分析技术。本文仅就最近十几年来DNA分子标记技术在中药鉴定方面的应用作一分析, 并就其应用前景进行讨论和展望。1 经典的DNA
7、分子标记技术此类技术的代表是限制性片断长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)。RFLP是最早发展的分子标记,是由Bostn首先提出,Soller和Beckman最先应用于品种鉴别和品系纯度的测定,这是最早发展的分子标记技术。其基本原理是利用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后,与同位素或非同位素探针标记杂交,从而显示与探针含同源顺序的酶切片段在长度上的差异。RFLP探针的来源主要是RG克隆和cDNA克隆,其中cDNA探针保守性较强,许多同科物种cDNA探针都可以作为通用探针。在实际应用过程中,人们普遍感到经典的RFLP技术须
8、经酶切、电泳、Southern转移、与探针杂交、放射自显影等步骤, 在实际应用中很不方便,费时费力,并受到探针来源的限制,多态性检出效率低(只能检测探针长度内切酶识别位点上的变异)。同时要求的DNA量较大,实验材料必须新鲜, 因此难以适用于干燥药材的鉴定,目前在中药鉴定领域已很少使用,已归为被淘汰的技术。在多源性中药材如伞形科北沙参、柴胡,菊科苍术属豆科甘草属,羽扇豆属,Yamazaki M,茄科澳茄属(Duborsia s ) Mizukami H,3种苍术Mizukami H的基原鉴定、资源分析及其地理品系(居群)间亲缘关系研究方面有了一些报道。2 基于PCR的DNA分子标记技术此类标记技
9、术的代表为:RAPD技术又称为锚定简单序列重复技术由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年提出。它用锚定的微卫星DNA为引物,即在SSR序列的3端或5端加上24个随机核苷酸,在PCR中,锚定引物可以引起特定位点退火,导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增interSSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨,扩增带多为显性表。ISSR标记技术特点:实验操作简单、快速、高效,不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤。ISSR标记技术结合了RAPD标记技术和SSR标记技术的优点,耗资少,模板DNA用量也少。200
10、3年以来,此标记技术受到许多学者的青睐,邱英雄等2031分别对明党参和川明参、南北五味子、罗汉果、金花茶、怀区地黄、铁皮石斛和黄精、麦冬、金钗石斛、丹参和半夏等药材的基因组DNA进行PCR扩增,建立并优化了ISSR-PCR反应体系,结果证明ISSR标记可以作为不同产地药材鉴别的有效分子标记。此外,2008年以来,李磊等3236分别对4种叶型性状半夏和掌叶半夏、山茱萸、银杏、益智和乌头等药材利用ISSR分子标记进行了分析,并取得良好结果。DNA序列分析技术以DNA序列为核心的分子标记技术。建立在PCR技术基础之上的DNA测序分析技术(DNA sequencing)的开发使DNA分子标记技术取得了
11、又一次的突破性进展。动植物在进化过程中,其基因会发生碱基的重排、替代等,从而导致基因序列的差异。通过检测其DNA片段序列的差异,即可将不同的种区别开来。近年来,由于DNA测序技术的发展以及人们对一些基因结构、功能的进化 规律 认识的更加深入,一些基因已用于动植物的进化与分类、物种鉴别研究。利用已知基因的结构、序列,可以为PCR引物的设计及目的基因的扩增提供前提条件。而基于PCR的DNA直接测序技术,极大地提高了DNA序列分析的效率,促进了该项技术的应用研究。目前用于中药DNA测序的基因主要有植物叶绿体基因组的rbcL,mat K rpoC 等;植物核基因组的rRNA、ITS等;动物线粒体基因组
12、Cytb基因等 ,这些被选基因的共同特点是进化速率差异大,基因序列变异大,基因序列均匀地分布于整个基因组,分辨率高,一般用于种级以上的分类系统研究以及分析研究动植物的亲缘关系与进化等。马小军等37402005年分别通过测定山参、大戟、巴戟天以及细辛和柴胡的序列,获得了可喜的效果 。此外,徐红等41472004年分别对川芎、西洋参、竹节参、石斛、姜黄、大黄、当归及小秦艽、肉苁蓉、广藿香、太子参、葛根等进行了药材鉴别,根据序列能够将研究对象区别开。动物类药材多用线粒体细胞色素b基因片段的序列变异鉴别药材。1998年吴平48通过分析对乌龟、中华鳖和山瑞鳖线粒体12S rRNA基因片段序列来区分正品和
13、混淆品;还通过扩增约450bp的12S rRNA和约490 bp的Cytb基因片段对海马作了DNA序列分析,可作为其它动物药材干样品鉴定的 参考 。1999年王义权等49扩增了乌梢蛇及其混淆品的Cytb基因片段,通过比较蛇的Cytb基因246 bp的同源DNA序列,可以准确区分乌梢蛇及其混淆品。3 评价与展望评价中药材品质鉴定是中药质量控制的首要环节,多年来人们一直在寻找科学有效的鉴定中药材的方法,从应用的现状不难看出DNA分子标记技术在该领域的应用已经取得了一些成绩。DNA分子标记技术作为中药材品质鉴定方法之一具有以下几点优势:微量、快速、特异性强、准确可靠,且不受药材生长发育阶段、供试部位
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