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HCV核心区基因的截短及其表达【摘要】 目的 高效稳定地表达HCV的核心抗原。方法 设计一对特异性引物，以含HCV全长基因的质粒pBR TM/HCV1-3011为模板，扩增出HCV截短的核心抗原的基因，克隆于表达载体pGEX-4T3,并转化于大肠杆菌BL21,IPTG诱导HCV截短的核心抗原的表达，表达产物经过SDS-PAGE,Western-blot,ELISA等一系列鉴定试验进行了分析。结果 成功地构建了HCV核心抗原高效稳定表达的重组质粒，表达产物具有高度特异性和良好的抗原活性。结论 该抗原的获得为研制诊断用HCV抗原奠定了基础。 【关键词】 HCV；核心区基因；截短；表达 Truncation and expression of HCV Core gene 【Abstract】 Objective To express HCV Core antigen hightly andA pairs of specific PCR primers were designed andHCV Core gene was amplified from the plasmid pBR TM/HCV1-3011 bygene fragement was cloned into pGEX-4T3,then transformed toBL21and expressed under induction of IPTG. The expressed product was analyzed by SDS-PAGE,Western-blot and indirect ELISA, A recombinant plasmidstable and hight expression was constructed successfully. The expressed product showed high specificity and goodThe expression of truncated HCV Core antigens laid a foundation for development of HCV diagnostis use antigens. 【Key words】 HCV；Core gene; Truncation； expression 丙型肝炎病毒的核心蛋白是HCV蛋白中抗原性强且保守性较好的区段，核心抗体出现时间早，大约于感染后812周即可检出，且持续的时间长，阳性率高，是HCV诊断必不可少的抗原之一1。为了研制HCV 诊断用抗原，最初构建了含HCV全长核心基因的重组表达质粒，但该质粒表达不稳定。参照有关文献24，笔者将HCV 的核心基因截短，构建了重组表达质粒，该质粒能够高效稳定地表达，现将结果报告如下。 1 材料与方法 11 实验材料 含HCV全长基因的质粒pBR TM/HCV1-3011由武汉大学生命科学学院叶林柏教授惠赠；pGEX-4T3购自Amersham Biosciences公司；pGEM-T载体为Promega公司产品；大肠杆菌JM109,DH5和BL21均由武汉生物制品研究所诊断用品室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶及TaqDNA聚合酶为Fermentas公司产品；凝胶回收试剂盒为QIAGEN GmbH公司产品；序列分析由宝生物工程公司完成。IPTG购于Fermentas公司；GST融合蛋白纯化试剂盒为Amersham Biosciences公司产品；鼠抗HCV Core抗原和NS3抗原的两种单克隆抗体购自ViroStat公司；HRP标记的羊抗鼠IgG为Novo Gene Bioscience公司产品；DAB浓缩显色液为华美生物工程公司产品；ELISA所用试剂，除抗原外，均为武汉所的HCV抗体诊断试剂盒的组份；标化血清由武汉所诊断用品室根据第5代HCV-Ab国家参比品(Panel)标定的血清 样品。 12 引物的设计与合成 根据pBRTM/HCV 1-3011全长基因序列，设计扩增HCV截短的(1-120aa)核心抗原基因片段的特异引物。 上游引物(L)：5G ACG CGT GGA TCC BamH I ATG AGC ACG AAT CCT AAA CC 3 下游引物(R)：5GTC CGC CGA ATT CGA EcoR I ACT ACC CAA ATT GCG CGA 3 上游引物L5端加了限制性内切酶BamH I酶切位点，下游引物R5端加入限制性内切酶EcoR I酶切位点。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 13 PCR扩增 以pBRTM/HCV 1-3011为模板，用上述引物扩增出截短的HCV Core区基因片段，取5l进行10%琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，按照DNA凝胶纯化试剂盒操作步骤纯化回收目的片段。 14 表达质粒的构建 纯化的目的基因片段，经T4DNA连接酶与pGEM-T载体连接，转化感受态JM109,筛选出阳性克隆，提取质粒后，经BamH I/EcoR I 双酶切反应，回收酶切产物，经T4DNA连接酶与经同样双酶切的pGEX-4T3连接，转化感受态DH5，提取质粒后，经BamH I/EcoR I 双酶切鉴定，筛选出含目的基因片段的阳性克隆，并测序，再将阳性克隆的质粒转化感受态BL21。 15 融合蛋白的诱导表达 将含有目的基因重组表达质粒pGEX-TP11的BL21菌株，接种于含100g/ml氨苄青霉素的2YT培养基中，37培养过夜后，按1：100比例转种于新鲜2YT培养基中，继续培养至对数生长期(A600=0507)，加IPTG至终浓度为1mmol/L,诱导45h，取菌体用于SDS-PAGE分析。 16 融合蛋白的纯化 将诱导表达的菌体超声破碎后，包涵体经洗涤，8mol/L尿素溶解，稀释复性，加50预处理的亲和层析介质Glutathione Sepharose 4B,按试剂盒说明书进行纯化。 17 Western-blot分析 纯化的嵌合抗原，经SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，按文献提供方法进行电泳转移5。一抗分别为130倍稀释的鼠抗HCV的Core抗原和NS3抗原的单克隆抗体，二抗为HRP标记羊抗鼠IgG，DAB显色。 18 HCV标化血清的鉴定 用包被缓冲液稀释纯化的融合蛋白至3g/ml，包被微孔板，每孔100l，4过夜，充分洗涤后,每孔加200l封闭液，4过夜，充分洗涤后加入按110 稀释的HCV标化血清。37孵育30min，充分洗涤后加入抗人IgG酶结合物，37孵育30min，充分洗涤，加显色底物显色10min，加入50l 2mol/L硫酸终止反应，在酶标读数仪上测定A450值。 2 结果 21 PCR扩增产物的鉴定 引物L、R设计扩增的片段长394bp，以质粒pBR TM/HCV1-3011为模板，用引物L、R扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见扩增的产物为约400bp的DNA片段,见图1，大小与预期设计相同。 22 克隆质粒的双酶切鉴定 HCV截短的(1-120aa)核心抗原基因克隆到载体pGEM-T上后的克隆质粒pGEM-TP11，经BamH I/EcoR I双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后，结果可见pGEM-TP11酶切产物大小约为400bp和3kbp左右的DNA片段，与预期结果相同，见图2。 23 重组表达质粒的双酶切鉴定 从转化的DH5中提取重组质粒pGEX-TP11，用BamH I/EcoR I双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见表达载体pGEX-4T3(约5kbp)及TP11(约400bp)基因两个片段，大小与预期设计的相同，见图3。 24 重组表达质粒的序列测定 测序结果表明pGEX-TP11中目的基因除了第68位氨基酸残基密码子由GCG突变为GCA为同义突变之外，其余序列与模板相同。 25 重组融合蛋白的诱导表达 将经鉴定过的表达质粒pGEX-TP11, 转化感受态BL21，挑取阳性克隆，经常规诱导表达后，取菌体作SDS-PAGE分析，结果显示，目的蛋白为相对分子量约40kD rGST-P11融合目的蛋白(Lane2)，与预计的表达产物分子量大小相符。SDS-PAGE凝胶经扫描分析表达产物占菌体总蛋白量的236，结果见图4。 26 纯化表达产物鉴定 含重组质粒pGEX-TP11的表达菌，经大量诱导培养后进行表达产物纯化，纯化过程中收集的各种样品进行SDS-PAGE分析。表达菌超声破碎后收集的上清和沉淀中均可见大量的约40kD rGST-P11融合目的蛋白(Lane1、2)，说明融合蛋白部分是以可溶形式表达，部分是以包涵体的形式表达；包涵体经尿素溶解后的上清有大量的目的蛋白，沉淀中有少量目的蛋白(Lane3、4)，说明包涵体已大部分溶解；表达菌超声破碎后收集的上清与50预处理的亲和层析介质Glutathione Sepharose 4B孵育后上柱，收集的流出液中可见 少量的目的蛋白(Lane5)，说明大部分目的蛋白已被Glutathione Sepharose 4B特异地吸附，而收集的PBS洗柱液可见少量目的蛋白和GST条带(Lane6、7)；收集纯化rGST-P11只可见一条约40kD目的蛋白带(Lane8),凝胶经扫描分析，其纯度为938,结果见图5。 27 表达产物Western-blot分析 纯化的重组融合蛋白rGST-P11,经SDS-PAGE电泳后，电泳转至NC膜，进行Western-blot分析，结果为重组融合蛋白rGST-P11只与鼠抗HCV Core抗原的单克隆抗体起反应，在分子量约40kD位置出现反应区带(Lane1)，而与鼠抗HCV NS3抗原的单克隆抗体不起反应，无任何区带(Lane2)，见图6。 28 HCV标化血清的鉴定 重组截短HCV Core抗原包被微孔板对41份HCV标化血清ELISA进行检测，结果23份阳性标化血清中，可检出20份，有三份的A值小于Cut off值，按20/23计算，阳性检出率为86；对18份阴性标化血清检测，均为阴性，阴性符合率100，结果见表1。表1 重组HCV Core抗原与41份HCV标化血清的ELISA结果 3 讨论 HCV的核心蛋白是HCV诊断必不可少的抗原之一，为了研制自己的HCV 诊断用抗原，本实验最先构建了含HCV全长核心基因的重组表达质粒pGEX- TP1，最初均有约47kD融合目的蛋白表达，含该质粒工程菌在液氮罐内冻存一段时间后，重新诱导表达时，均不再有目的蛋白的表达。将冻存含正确序列pGEM-TP1质粒重新酶切，重新构建pGEX-TP1表达质粒，也没有目的蛋白的表达。因此，没能纯化出全长的Core抗原。据文献报道，核心蛋白所含碱性氨基酸较多，精氨酸和赖氨酸占15%。研究发现，全长型核心蛋白很难获得稳定表达，而截短型Core蛋白，通过羧基端缺失,去除疏水区对表达的影响，原核表达高效且稳定，在真核细胞中也有较高水平的表达4。据此，重新合成引物，将Core区截短，构建了重组表达质粒pGEX-TP11，获得了稳定的表达，表达量占菌体总蛋白量的236。 纯化的表达产物进行Western-blot分析，结果只与鼠抗HCV Core抗原的单克隆抗体起反应，而与鼠抗HCV NS3抗原的单克隆抗体不起反应，证明了其抗原的特异性良好。 纯化的表达产物包被微孔板后，对41份HCV标化血清进行了ELISA检测， 23份阳性HCV标化血清可检测出20份阳性，阳性检测率为86，如包被的抗原中增加NS3、NS4、NS5抗原，其阳性检测率将会大幅度增高；对18份阴性HCV内控血清检测全部为阴性，阴性符合率为100，说明表达产物具有高度特异性和良好的抗原活性。 【参考文献】 1 Abdel-Hamid M,El-Dalym,El-Kaframy S,et al. Comparison of second and third-generation enzyme immunoassays for detecting antibodies toClin Microbiol,2002,40(2):1656-1659. 2 金奇.医学分子病毒学.北京：科学出版社，2001,348-366. 3 朱为，刘桂珍，史晓明，等. HCV C区基因片段的克隆、表达及纯化.中国生物制品学杂志，2001，14：1720. 4 胡刚，薛小平，董小慧,等.丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达.生物技术，2004，14：4-5. 5 J.萨姆布鲁克 拉塞尔着，黄培堂等译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，2002,1723-1726.