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中草药抗结核分枝杆菌的实验室研究
【摘要】 目的：在实验条件下观测部分中草药在单味和复方组合下，对结核分枝菌的抗菌活性。方法：采用琼脂绝对浓度法，加入不同浓度的单味或复方中草药，接种结核分枝杆菌，在37 ℃下培养一个月。结果：大蒜液1∶10；百部液1∶5；夏枯草液1∶5有抑制结核菌生长作用；而大蒜百部混合液1∶20；夏枯草大蒜混合液1∶20；夏枯草百部混合液1∶10；大蒜夏枯草百部混合液1：40均有抑制结核分枝杆菌生长的作用。结论：三种中草药在实验条件下均有抗结核分枝菌的作用，联合药效比单药的作用强。
【关键词】 中草药 结核分枝杆菌 药物敏感性试验
Abstract Objective：To observe the effect of some Single or Compound Mixture Traditional Chinese Medicine on the activity of mycobacterium tuberculosis. Methods: HV37 cells (mycobacterium tuberculosis) were cultured with single or compound mixture traditional Chinese medicines in various concentrations for one month at 37 ℃ by Agar absolute concentration. Results: Garlic liquid with a radio of 1∶10, stemonae liquid with 1∶5 and brunellae spica with 1∶5 all could inhibit the growth and multiplication of mycobacterium tuberculosis. Furthermore, garlic and stemonae mixture with 1∶20, garlic and brunellae spica mixture with 1∶20, stemonae and brunellae spica mixture with 1∶10 and three kinds of matters mixture with 1∶40 could suppress the growth of : Single garlic, stemonae or brunellae spica could depress the mycobacterium tuberculosis’s growth. Meanwhile, the effect of compound mixtures are better than that of single.
Key words Traditional Chinese Medicine；Mycobacterium tuberculosis；Medicament tendemess test
结核病近30年来，无论在发达国家还是发展中国家，无论是在经济发展的地区还是经济落后的地区，都呈上升的趋势，其主要的原因是结核分枝杆菌形成了对目前所用的抗结核病的药物的抗药性，使得原有的抗痨方案和抗结核病的治疗规程失去了应有的作用，使得结核病卷土重来，直接影响着人们的健康水平和经济发展，控制结核病的发展是摆在我们面前的重要任务。目前在这个领域中有两个重大的课题需要人们进行研究和探讨，其一是研究其耐药性产生的机制，并寻找其耐药性检测的方法；其二是寻找敏感高效的抗痨药物，重新制定新的抗痨规程与方案，使其治疗更加有效，从而控制结核病的蔓延。近年来我们实验室在这些方面做了许多工作，如结核分枝菌的快速培养法，结核分枝菌耐药性的尿素酶检测法等。同时对多种中草药抗结核分枝杆菌的作用在实验条件下进行研究，现将部分中草药抗结核分枝菌的结果发表如下。
1 材料与方法
　材料
　菌种：菌株购自中国生物药物鉴定所细菌室。
　培养基：绝对浓度法采用豆浸液改良罗氏培养基。
　中草药：大蒜，百部，夏枯草均购自长治医学院附属医院中药房。
　链霉素：购自华北制药有限公司，硫酸链霉素纯品。
　方法
　结核分枝杆菌培养基的制备［１］：成分：天门冬素 g,枸橼酸镁 g, kH2pO4　g,MgSO·7H2O　g，马铃薯淀粉30 g，甘油12 mL,豆浸液600 mL；。
制备方法：将上述各成分加入600 mL豆浸液中，加温溶解，待冷却后，加入全鸡蛋1 000 mL，再加入2%孔雀绿20 mL，待用。
　琼脂绝对浓度法培养基的制备与药物的浓度：绝对浓度法严格按照中国防痨协会，结核病诊断细菌学检验规程的方法操作。
　中草药的配制［２］：取大蒜，百部，夏枯草各10 g，加100 mL蒸馏水，煮沸30 min，去药渣，补充水分到100 mL，在蒸沸皿中蒸沸浓缩到10 mL，冰箱保存备用。
　含单味中草药结核菌培养基的制备：将上述制备好的结核培养基8 mL放入中粗试管中，加浓缩好的中药原液2 mL，使其中药的浓度为1∶5，然后进行对倍稀释至第5管，即1∶80，将制备好的含药培养基，置血清凝固器中，间隙灭菌三次，冰箱保存，备用。
　　　含两种以上中草药结核培养基的制备［3～5］：按两种药1∶1或三种药1∶1∶1的比例，配置中药复合组，然后按单味中药结核分支杆菌培养基的制备方法，制备含复方中药的结核分支杆菌培养基。
　试验菌液的配制：接种于豆浸液结核分枝杆菌培养基培养20 d，待生长至培养基斜面的1/3以上时，用硫酸钡比浊管比浊，用生理盐水配成105/mL～106/mＬ菌悬液，待用。
　接种与培养6，7：取 mL试验菌液，平涂于培养基的斜面，要涂满整个斜面，平置于桌面，待干后，置37 ℃培养箱中，培养20　d～30　d，从第7 d开始每天观测1次。同时要接种2支空白对照管。待空白对照管的结核分枝杆菌的菌落长到培养基斜面的1/3以上时终止培养，记录结果。
　硫酸链霉素的稀释法8：并按照中国防痨协会，结核病诊断细菌学检验规程的方法操作［1］稀释成2　000　000　μg/mＬ的使用液，然后用上述结合分枝杆菌培养基，进行10倍稀释，使培养基中链霉素的最终浓度为：200　000　μg/mＬ，20　000　μg/mＬ，2　000　μg/mＬ，200　μg/mＬ，20　μg/mＬ，间歇灭菌后待用。
2 结果
在实验条件下，链霉素在200 μg/mL以上浓度时，在37 ℃下，培养30 d未见结核分枝杆菌生长；与链霉素相比较，大蒜在1∶10的浓度时相当于链霉素200 μg/mL的效果，百部和夏枯草在1∶5的浓度时相当于链霉素200 μg/mL的效果；二种中草药联合后，大蒜、百部以及夏枯草大蒜混合液其1∶20的浓度时相当于链霉素200 μg/mL的效果；三种药联合后即夏枯草大蒜百部混合液1∶40的浓度时相当于链霉素200 μg/mL的效果。具体结果见表1。表1 三种中草药单味、复方与链霉素抗结核分支杆菌的结果比较注：“+”为生长；“-”为不生长
3 讨论
由于耐药结核菌的出现，结核病合并感染HIV，结核病控制系统的减弱以及移民的增加，结核病的流行状况再次呈现上升趋势。从丰富的中药资源中寻找有效的抗结核药物， 已引起越来越多的重视．数十年来，国际上针对结核菌已开发出近二十种药物，但均存在副作用大，易产生耐药性等缺点。特别是近年来耐药及多重耐药菌株(multiple drugs resis-tant-bacillus tuberculosis，MDR-TB)的出现，更是对现有的抗结核药物提出了严重挑战，同时，从化学合成物中寻找有效药物的难度日益增大，因此，近年来从我国丰富的中药资源中寻找有效的抗结核药物，已引起越来越广泛的重视。
我国传统中医药自2000多年前即有关于抗结核治疗的记载。近年来，国内研究者除采用传统方法，即中药对结核病的治疗作用进行临床研究外，还进行了中药对结核菌的体外抑菌作用，中药对结核菌感染免疫力影响等方面的研究，有的甚至已深入到分子和基因水平。本文采用了绝对浓度法对三种中草药在实验条件下对结核分枝活性进行了实验室研究。就上述研究的结果分析，这三种中药在体外均有抗结核分枝菌的作用，而且在不同浓度下显现出了明显的抑制结核分枝菌生长的作用，而三种中药的不同组合也明显表现出比单味药更具有抗结核分枝菌生长的作用，如大蒜百部夏枯草的混合液在1∶40倍稀释后其抗菌活性相当于链霉素200　μg/mL的杀菌效果。这一结果为临床在抗结核病的药物选择上提供了有力的依据，为采用中西医药物治疗结核病，提供了证明。中草药种类较多，各种药物的成分复杂，其抗菌的机制也不仅相同，大多都不十分明白其机制，但有的中草药经过多年的研究其机制较为明白。如大蒜的抗结核分枝杆菌的机制是：大蒜素是鲜大蒜所含大蒜氨酸，经大蒜酶分解产生。体外抑菌实验结果表明，高浓度大蒜素对结核菌有很强的杀菌和抑菌作用，其机制可能是大蒜素分子中的氧原子与细菌生长繁殖所必须的半胱氨酸分子中的巯基结合，抑制结核菌蛋白质合成，同时抑制了细菌旋转酶而使DNA复制受阻并降解，而致结核菌死亡［9，10］。
目前的体外实验大都采用传统MIC方法，但由于结核菌是一种胞内寄生菌， 同时中药成分复杂进入体内经过代谢后，其成分必然发生很大变化，因此，MIC方法得出的结论， 可能完全不符合药物在体内的真实情况［１1］；而现有研究中，大多以研究西药的方法和思路去研究中药，对中药的整体性作用重视不足；新技术、新方法应用不多。目前诸如基因指纹、基因芯片、细胞凋亡、细胞模型、含药血清等新技术、新方法，在整个天然药物研究领域应用较多，但其在抗结核中药研究中还鲜见应用。中药资源丰富，成分复杂，尤其是中药可通过多组分、多靶点和整体协同作用发挥抗结核作用．与西药相比具有毒副作用小，不易产生耐药等独特优势。因此，有理由相信，在结核病防治的当前形势下，从中药中寻找有效的抗结核药物定会有光明的前景。
【参考文献】
［1］ 刘金伟，王金河，仲 斌，等．大蒜素结核杆菌体外抑菌效果观察．人民军医，2001，44(4)：236.
［2］ 匡铁吉，董 梅，宋 萍，等．黄连素对结核分枝杆菌的体外抑菌作用．中国中药杂志，2001，26 (12)：867．
［3］ 胡树德．中药优福宁的毒性及体外抗结核活性的实验研究．中国中药科技，1998，5(1)：12．
［4］ 詹 莉，戴华成，杨治平，等．小毛莨内酯影响耐药结核患者外周血淋巴细胞SHSP和GLS表达的研究，中国中药杂志，2002，27(9)：677．
［5］ 徐瑞兰．猫爪草胶囊治疗颈部淋巴结结核204例临床分析．中国防痨杂志，2002，24(1)：54．
［6］ 张玉明．猫爪草胶囊加基本化疗方案治疗初发肺结核．临床肺科杂志，2002，7(4)：85．
［7］ 李华安，李洪栋，曲 迅，等．水车前抗结核的初步研究．中国中药杂志，1995，20(2)：115．
［8］ 贺新怀，席孝贤主编．中医药免疫学．北京：人民军医出版社，2002：296．
［9］ 郭 威，刘佳文，马伟路，等．扶正益气合剂抗结核杆菌活性的初步研究．临床肺科杂志，2001，6 (1)：24．
［10］ 李建国，樊蔚虹， 张 莉，等．抗痨颗粒药理作用的实验研究．中国中医药信息杂志，2000，7(7)：21．
［１1］ 陈小红．复治肺结核加用抗痨合剂疗效观察．湖北中医杂志，2001，23(12)：15．