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不同提取方法赶黄草提取物清除DPPH自由基的作用研究
【摘要】　　目的研究赶黄草提取物对DPPH自由基的清除作用。方法采用不同溶剂、不同提取方法制得赶黄草提取物，以抗坏血酸为对照，研究其对DPPH自由基的清除作用。结果不同溶剂提取物对DPPH自由基清除率强弱依次为95 %乙醇水丙酮，不同极性部分对DPPH自由基清除率强弱依次为醋酸乙酯部分正丁醇部分水部分石油醚部分，赶黄草提取物浓度达到一定浓度后与抗坏血酸对DPPH自由基清除能力相当。结论回流提取法是最适合提取赶黄草中有效成分的方法，赶黄草95 %乙醇回流提取物具有良好的清除DPPH自由基的能力，醋酸乙酯部分清除DPPH自由基能力最强。
【关键词】　赶黄草； DPPH自由基； 清除率
　　Abstract：ObjectiveTo study the extracts from Penthorum chinense Pursh on scavenging DPPH free radical. MethodsThe DPPH scavenging activities of Penthorum chinense Pursh extracted by different methods and different solvents were studied and compared with that of ascorbic acid. ResultsThe scavenging activity was decreased in the order of Penthorum chinense Pursh extracts obtained from 95 % ethanolwateracetone, and Polar different parts on DPPH free radical strong scavenging activity were part of ethyl N-butanol water petroleum ether. Penthorum chinense Pursh extract and ascorbic acid in a certain concentration had the same DPPH free radical scavenging　reflux is the best method, 95 % ethanol extract has good activity to scavenge the DPPH free radical, and ethyl acetate the most strong seavenging activity to DPPH free radical.
　　Key words：Penthorum chinense Pursh; DPPH free radical; Scavenging activity
赶黄草为虎耳草科扯根菜属Penthorum Gronvexl植物扯根菜Penthorum chinense Pursh的干燥地上部分［1］。赶黄草为苗族民间的草药，主要分布于四川、贵州、湖南等地，具有清热解毒、退黄利湿、活血散瘀、利水消肿之功效［2］。赶黄草中含有黄酮、有机酸、挥发油等成分，其中没食子酸和槲皮素为赶黄草中有效成分［3］，具有抗乙肝病毒和保肝的作用。对于赶黄草清除DPPH自由基的活性研究及其抗氧化研究尚未见报道。
衰老、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧化和自由基有直接关系，因为自由基可与生物体内的许多物质如脂肪酸、蛋白质等作用，夺取它们的氢原子，造成相关细胞的结构与功能的破坏，更重要的是其氧化产物和中间产物会伤害生物膜、酶、维生素、蛋白质及活细胞功能，其中一些还被认为是致癌物质，因此对消除自由基的探讨已得到普遍关注［4］。清除自由基的检测方法很多，如 电子 顺磁共振法、电子自旋共振法、化学发光法等，但这些方法大多需用昂贵的仪器，一般实验室难以。DPPH分析法是一种筛选自由基清除剂，评价抗氧化活性的简便方法［5］。当有自由基清除剂存在时，由于其与DPPH中电子配对使DPPH液吸收逐渐消失，DPPH液褪色程度与配对电子数成化学计量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。为了了解赶黄草的抗氧化性质，进而阐明其所具有的抗病毒保肝作用机制，本文对赶黄草提取物清除DPPH自由基的活性进行了研究。
　　1 仪器与试剂
双光束紫外可见分光光度计TU-1901(北京普析通用仪器有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱 (北京市永光明医疗仪器厂)，超声清洗仪(昆明市超声仪器有限公司)，数显恒温水浴锅(江苏省荣华仪器制造有限公司)。
二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)，购自sigma公司。
供试药材赶黄草2007-10下旬采自湖南浏阳，由湖南中医药大学周日宝教授鉴定为虎耳草科植物赶黄草Penthorum chinense Pursh。
　　2 方法
　　赶黄草有效成分的提取
　　回流提取法准确称取药材 g，加入10倍量的溶剂，回流提取2 h，重复两次，将提取液过滤，滤液真空浓缩至浸膏，干燥待用。
　　超声提取法准确称取药材 g，加入10倍量的溶剂，加热超声2 h，重复两次，将提取液过滤，滤液真空浓缩至浸膏，干燥待用。
　　温浸法准确称取药材 g，加入10倍量的溶剂，温浸2 h，重复两次，将提取液过滤，滤液真空浓缩至浸膏，干燥待用。
　　不同极性溶剂萃取法准确称取药材 g，以“”方法用75 %乙醇提取两次，提取液经真空浓缩至小体积，依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，所得各萃取部分浓缩成浸膏，干燥待用。
　　赶黄草提取物清除DPPH自由基能力的测定
　　清除率的测定精密称取 mg DPPH于50 ml容量瓶中，用95 %乙醇溶解；样品溶解于95 %乙醇溶液中。取样品溶液1 ml加入到离心管，再加入3 ml的DPPH溶液配成样品溶液。95 %乙醇溶液1 ml加入到离心管，再加入DPPH溶液3 ml配成未加样品液的DPPH溶液。取样品溶液1 ml加入到离心管，再加入3 ml的95 %乙醇配成样品空白溶液。上述溶液在室温下离心20 min后用紫外分光光度计在517 nm下检测。测定样品溶液吸光度Ai，未加样品液的DPPH溶液吸光度Ac，样品空白溶液吸光度Aj。根据下列公式 计算 清除率
清除率=［1－／Ac］×100%
　　半清除率的测定抗氧化剂清除自由基能力采用清除DPPH的半清除率表示。将待测液配制成不同浓度溶液，测定DPPH自由基清除率，并绘制DPPH自由基清除率对待测液浓度曲线，由曲线读取或用方程计算出DPPH自由基清除率为50 ％时所需赶黄草提取液浓度，计算出赶黄草提取液中溶质质量，按公式计算IC50值。溶质质量所需浓度越低，表明半清除率越高。
IC50=50％×消耗的DPPH质量／加入的试样溶液中溶质的质量
　　3 结果
　　DPPH吸收光谱与测定波长的确定 DPPH在溶液中具有典型紫红色，当它与能提供1个电子的自由基清除剂作用时，生成浅色产物，使溶液的典型紫红色变浅。测定DPPH溶液在200～600 nm之间的光谱，由图1可知，DPPH溶液在醇-水体系中其327 nm和517 nm处吸光度都具有极大值，但517 nm处的极大值在加入槲皮素后降低较显着，故选用在95%乙醇体系下517 nm处DPPH含量的变化来进行测定。
　　DPPH溶液稳定性实验测定DPPH在95 %乙醇中吸光度变化与时间的关系，结果显示DPPH的吸光度在40 min内基本不变。加入样品后，测定吸光度与时间的关系，发现吸光度随时间增长呈线性降低，但30 min后，吸光度的变化已经很小。结果见2。为了提高测试准确度，在加入样品反应20 min后，迅速测定吸光度。

　　抗氧化剂浓度与其清除DPPH的关系抗坏血酸、没食子酸和槲皮素是常见的抗氧化剂［6］，配制槲皮素、抗坏血酸、没食子酸标准溶液，逐级稀释使用。按“”方法测定，图3可见抗氧化剂浓度在一定范围内，随着浓度的增高，清除DPPH自由基的能力逐渐增大。各抗氧化剂浓度与清除率之间线性方程分别表示如下，槲皮素：Y= 6×103C+ 7，R2= 9；没食子酸：Y= 1×103C+ 4，R2= 0；抗坏血酸：Y= 6×103C+ 4，R2= 5。可见，在一定范围里，可以用清除率来表示抗氧化剂SPPH自由基的清除能力。
从图3曲线可知，采用清除率极大值点或其他特征点所对应的抗氧化剂含量来比较DPPH自由基清除能力的方法比较合理。由于极值点测定比较困难，误差较大，而自由基清除率在50%时对应的点较容易在曲线上标定，因此选定抗氧化剂的自由基半清除率IC50值为测定指标。采用该法测定的槲皮素、抗坏血酸、没食子酸的IC50为，，。结果见图4。

　　不同提取方法清除DPPH自由基的能力按“”，“”，“”不同方法提取，使用相同溶剂得到提取物，逐级稀释，按“”方法测定，结果见图5。

　　不同提取方法得到的提取物都具有一定的清除自由基的能力，在一定浓度范围内，呈现正向变化，但随着浓度增加到一定值后，清除率趋于平缓。回流提取得到的提取物的IC50为，超声提取得到的提取物的IC50为，温浸提取得到的提取物的IC50为，回流提取得到的提取物的IC50最高。
　　不同溶剂提取物清除DPPH自由基的能力按“”回流提取法分别用95 %乙醇，水，丙酮提取，逐级稀释，按“”方法测定。结果见图6。

　　3种溶剂提取物都具有一定的清除自由基活性的能力，且随着提取物浓度增加，清除率逐渐增高，但随着浓度增加到一定值后，清除率趋于平缓。在浓度范围内，赶黄草95 %醇提物的IC50为，水提物的IC50为，丙酮提取物的清除能力最弱，IC50为。其差异可能是因为溶剂的极性不同，使其对赶黄草中抗氧化活性物质的溶解度不同，所提取的抗氧化物质的总量和种类也就不同，导致了不同溶剂提取液的清除DPPH自由基能力不同。
　　不同极性部分清除DPPH自由基的能力根据实验结果，选择回流提取法，按“”方法将提取液萃取为极性不同的4个部分：石油醚部分，醋酸乙酯部分，正丁醇部分以及水部分。按方法“”测定。结果见图7。
从图7看出，在4个不同的极性部分中，清除DPPH自由基能力最强的部分是醋酸乙酯部分。赶黄草有效成分主要是黄酮化合物如槲皮素等存在于该极性部分，表明赶黄草中黄酮化合物具有较强的清除自由基的能力。

　　与抗坏血酸的清除自由基能力比较抗坏血酸是常用的抗氧化剂，将乙醇提取物按不同浓度用“”项下方法测定，与相应浓度抗坏血酸比较，由图8可知，赶黄草乙醇提取物的清除自由基能力在达到一定浓度后接近抗坏血酸用的水平。

　　4 结论
回流提取法是最适合提取赶黄草中有效成分的方法，其具有操作简单，方法稳定的特点。
　　赶黄草提取物均具有清除DPPH自由基的作用，95 %乙醇提取物的清除DPPH自由基作用最强，以下依次为水、丙酮提取物。 不同方法提取物清除DPPH自由基的结果表明，在一定浓度范围内，赶黄草提取物浓度越大，其清除自由基能力越强。
在石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4个不同极性部分中，清除DPPH自由基能力最强的部分是在醋酸乙酯萃取部分。
赶黄草种质资源在四川、贵州、湖南都有分布，但目前其　价值被开发利用(药用、保健)的还很少。本研究通过对赶黄草提取物中具有抗氧化作用的活性物质对DPPH自由基的清除能力进行了考察，证明了赶黄草具有很强的抗氧化作用，这对于赶黄草的综合利用和进一步开发具有重要意义。
【 参考　文献 】
　　［1］ 中国　科学 院植物研究所．中国高等植物属检索表［M］．北京：科学出版社，1979：205．
　　［2］全国中草药汇编编写组．全国中草药汇编，下册，第2版［M］．北京：人民卫生出版社，2000：480．
　　［3］张 旭，杨 明．赶黄草有效成分研究［J］．成都中医药大学学报，2005，25：46．
　　［4］Meydani M Blumberg A. Antioxidants and aging immune response．IN Bendich A，Phillips M, Tengerdy Reds antioxidants Nutrients and immune functions［M］．New York and London：Plenum press,1990：57.
　　［5］Bors S W，Van beek T A．Screening of plant extracts for antioxidant activity, a comparative study on three testing methods［J］．Photochemical Analysis，2002，13(1)：8.
　　［6］成喜雨，崔 謦，刘春朝，等．中草药抗氧化活性研究进展［J］．天然产物研究与开发，2006，18：514．