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新生鼠脑缺血预处理后海马CA1区GAP
【摘要】 目的： 观察新生Wistar鼠脑缺血再灌注后海马CA1区生长相关蛋白43的表达和意义. 方法：通过阻断7日龄新生Wistar大鼠右侧颈总动脉45 min制备脑缺血模型，设置假手术组、缺血再灌注组和预缺血缺血再灌注组. 采用免疫组化方法和计算机图像分析技术检测三组新生鼠不同时点海马CA1区脑组织GAP43的动态变化及三组光镜下脑组织病理改变. 结果： ①脑组织病理改变：假手术组大鼠无异常病理改变，缺血再灌注组神经细胞变性、坏死，预缺血组病理损伤较缺血再灌注组轻. ②GAP43表达：缺血再灌注组海马GAP43表达在再灌注后24 h时开始增高，7 d达高峰，至14 d与假手术组比较差异有统计学意义；预缺血缺血再灌注组GAP43表达较缺血再灌注组增加更明显，与假手术组和缺血再灌注组比较均差异有统计学意义. 结论： 新生鼠脑缺血预处理可减轻再次严重脑缺血对神经细胞的损伤，脑缺血预处理后海马CA1区GAP43表达和合成增加，GAP43表达增加可能与神经元再生和轴突重塑有关，是脑缺血后神经细胞内源性代偿机制之一.
　　【关键词】 脑缺血;缺血预处理；生长相关蛋白43；海马；Wistar大鼠；新生
　　0引言
　　神经生长相关蛋白43(growthassociated protein43, GAP43)是一种神经细胞膜上的特异性磷蛋白，在神经系统的发育和损伤再生中，常能检测到GAP43在mRNA和蛋白水平上的明显升高，被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子［1］，在神经发育和再生过程中呈现高表达，能调节神经元对轴突引导信号的反应，在引导轴突生长和调节轴突形成新的联系上起关键作用，是神经元发育和可塑性的分子标志物［2］，GAP43基因敲除大鼠其神经发育障碍［3］. 研究发现，一次短暂的脑缺血可明显减轻再次严重缺血造成的神经元损害，此现象称脑缺血预处理或缺血耐受［4］，对防止器官因再次严重缺血造成的损伤有保护作用. 本研究我们观察了新生鼠脑缺血预处理对海马CA1区GAP43表达的影响，探讨GAP43在新生鼠脑缺血后神经细胞反应性再生、结构重建以修复损伤的作用.
　　1材料和方法
　　材料生后7 d Wistar大鼠，体质量18~22 g，共90只，雌雄不拘，随机分为假手术组、缺血再灌注组、预缺血缺血再灌注组. 每只鼠用1000 U青霉素腹腔注射预防感染，用30 g/L戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉. 抗GAP43抗体，购自武汉博士德公司，兔抗鼠多克隆抗体，编号为BA0878.
　　方法
　　脑缺血模型的制作假手术组:分离右侧颈总动脉，不阻断血流；缺血再灌注组：阻断右侧颈总动脉45 min再灌注；预缺血缺血再灌注组：微小止血夹阻断右侧颈总动脉8 min，恢复灌注24 h，再次阻断同侧颈总动脉45 min. 三组均于术后3 h，12 h，24 h，3 d，7 d，14 d断头处死，取右侧大脑半球用40 g/L多聚甲醛固定待测；6个时点，每个时点5只，每组30只，共90只. 判断脑缺血模型成功标准：结扎右侧颈总动脉后2 h对侧(左侧)肢体活动障碍.
　　海马切片的制备及GAP43的检测(免疫组织化学Envision 二步法)取各实验组大鼠右侧大脑半球用40 g/L多聚甲醛固定12 h，石蜡包埋，进行海马CA1区、皮层连续冠状切片，片厚4 μm. 切片常规脱蜡和水化，蒸馏水漂洗后置于PBS中，用30 mL/L过氧化氢避光孵育20 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS漂洗5 min×3次，加20 μL一抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，加20 μL相应的EnvisionTM复合物，37℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，DAB显色，蒸馏水漂洗，封片. 以PBS代替一抗作阴性对照.
　　图像分析用Mias992B图像分析系统(四川大学图象图形研究所研制)测量切片海马CA1区GAP43 A值，每只鼠3张切片，每张切片测2次，每次所测面积50%海马CA1区，取其平均值作为GAP43的A值； 同时测定同一张切片上胼胝体的光密度值作为其背景值. 实测值减去背景值得矫正吸光度(CA)，用CA值进行比较和分析，以避免染色过程中非特异性染色所造成的误差.
　　脑组织病理学检查取相应部位切片行HE染色，观察其病理学改变.
　　统计学处理： 数据以x±s表示，用SPSS 统计软件进行分析，采用单因素方差分析，并结合LSD检验进行两两均数比较；为差异有显着性.
　　2结果
　　病理学改变假手术组未见神经元损伤，缺血灌注组大鼠海马CA1区神经细胞自缺血12 h开始可见水肿、神经细胞灶性液化性坏死及胶质细胞浸润，以第3日为最重；预缺血组海马CA1区神经细胞病理改变较缺血灌注组轻，可见神经细胞变性、水肿，少量细胞出现坏死(图1).
　　图13 d海马CA1区HE ×400　略
　　三组新生Wistar大鼠海马CA1区GAP43表达经复染后GAP43阳性染色呈棕黄色点状或颗粒状沉积，位于胞质内，阴性对照切片未见GAP43免疫反应产物. 假手术组海马CA1区可见GAP43表达，随日龄增加免疫反应产物CA值逐渐增高；缺血灌注组和预缺血组海马CA1区GAP43在脑缺血再灌注1 d免疫活性增高，7 d达高峰，14 d时免疫活性仍高；脑缺血再灌注组和预缺血组24 h，3 d，7 d，14 d CA值高于假手术组，两组CA值与假手术组比较差异有统计学意义()，并且脑缺血再灌注组和预缺血组CA值相比较差异有统计学意义(，表1，图2).
　　表1大鼠海马CA1区GAP43表达(略)
　　图27 d GAP43表达×400　略
　　3讨论
　　GAP43是近年来分离鉴定的一种Mr为24×103的钙调蛋白结合的胞膜磷酸蛋白质，广泛存在于神经组织的神经元中，特别在生长、分化、再生的轴突末端含量极高，主要作用是启动生长锥形成，并使其附着、延伸和抵抗回缩因素的影响，在引导轴突生长和调节轴突形成新的联系上起关键作用，是决定神经发育、轴突再生、突触重建的可塑性特异性标志蛋白质［5］. 在神经元的发育和再生过程中, GAP43伴随着轴突的生长在神经组织内大量合成［6］，其表达产物主要位于轴突生长锥质膜面,该蛋白通过加速生长锥基部胞质膜的扩展而促进轴突生长；对大鼠脑皮质缺血后GAP43表达研究发现，在缺血区细胞死亡引起了周围存活神经元轴突末梢GAP43曾高表达［7-8］，脑损伤后GAP43不是无限量无限期的增加,它在损伤的早期即刺激强度较大时增加明显,随着损伤修复过程的发展，GAP43的量不断减少,一旦代偿的突触联系重新建立完成，GAP43的量也降到了原来的基础水平；本实验结果表明，大鼠脑缺血再灌注24 h后，在缺血组海马CA1区GAP43表达逐渐增高，第7日达高峰，14 d与假手术组比较仍有显着差异；而缺血预处理组GAP43表达较缺血再灌注组增加更明显. 这说明在缺血缺氧脑损伤后，神经系统启动保护机制并修复受损的神经元，通过GAP43的表达增加，促进突触的不断生长是神经进行修复的重要方式之一. Kitagawa等［9］在沙土鼠脑缺血的实验研究中观察到短暂性脑缺血预处理具有神经保护作用，首次提出脑缺血预处理的概念：即机体对短暂缺血的适应性反应，能增加神经元对再次严重脑缺血的耐受性；随后在临床和动物实验均证实脑缺血预处理的神经保护作用［10］. 本实验结果显示缺血预处理组脑组织病理损害较单纯缺血再灌注组轻，脑缺血预处理能对防止再次严重的脑缺血损伤有较好的保护作用；而缺血预处理组海马CA1区GAP43表达较缺血再灌注组增加更明显，提示经脑缺血预处理后反映神经元侧支出芽和反应性轴突再生更活跃，其神经细胞GAP43表达增加是神经系统受损后的内源性保护机制之一.
　　【参考文献】
　　［1］ Benowitz LI, Routtenberg A. GAP43: An intrinsic determinant of neuronal development and plasticity［J］. Trends Neurosci, 1997, 20(2): 84-91.
　　［2］ Miyake K, Yamaoto W, Tadokoro M, et al. Alterations in hippocampal GAP43, BDNF, and L1 fowllowing sustained cerebral ischemia［J］. Brain Res, 2002, 935(12): 24-31.
　　［3］ Maier DL, ManiS, Donovan SL, et al. Disrupted Cortical map and absence of cortical barrels in growthassociated protein (GAP)43 knockout mice［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(16): 9397-9462.
　　［4］ Ran R, Xu H, Lu A, et al. Hypoxia preconditioning in the brain［J］. Dev Neurosci, 2005,27(24):87-92.
　　［5］ Dani JW, Armstrong DM, Benowitz LI. Mapping the development of the rat brain by GAP43 Immunocytochemistry［J］. Neuroscience, 1991, 40(1): 277-287.
　　［6］ Stroemer RP, Kent TA, Hulsebosch CE. Neocortical neural sprouting, synaptogenesis, and behavioral recovery after neocortical infarction in rats［J］. Stroke, 1995,26(11):2135-2144.
　　［7］ Luque JM, Puig N, Martinez JM, et al. Glutamate NmethylDaspartate receptor blockade prevents induction of GAP43 after focal ischemia in rats［J］. Neurosci Lett, 2001, 305(2): 87-90.
　　［8］ Zhang Y, Bo X, Schoepfer R, et al. Growthassociated protein GAP43 and L1 act synergistically to promote regenerative growth of Purkinje cell axons in vivo［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2005, 102(41):14883-14888.
　　［9］ Kitagawa K， Matsumoto M，Tagaya M, et al. “Ischemic tolerance” phenomenon found in the brain［J］. Brain Res， 1990, 528(1): 21-24.
　　［10］ StenzelPoore MP, Stevens SL, Xiong Z,et al. Effect of ischaemic preconditioning on genomic response to cerebral ischaemia: Similarity to neuroprotective strategies in hibernation and hypoxiatolerant states［J］. Lancet， 2003,362(9389):1028-1037.