非洲猪瘟病毒免疫及基因工程疫苗研究进展.docx

中国畜牧兽医。机曲 N+i曲 枷母.海湖料ViVyW 如幅非洲猪瘾病毒第痿蔑基国工程痿菌研窕涯展辱泰金祥（潮蚌程入学车神等呻再弊糠，.呻幡琴欢蓦，瑚卿a枷灿如免疫can swine fe ican swine lever virus,炮池分僭叫艇寮脚-2f装凿顺蹒瘢艇s，w 矣技献淌廨峨豌婵州晶醐罟盾峻冤谿蹭腿甦抵r展望。本置|势类掌洗崩琵./痘（1ASFV）；姗血税噬A免疫应答;基因工程疫苗回解纬常43训函估71-7236. 2函尊柄昭曾：A开放科学（资源服务）标识码（OSID）： +Doi： 10. 16431/ki. 1671-7236.2019. 11.031开放科学（资源服务）标识码（OSID）：号回Research Progress on Immune Response and Genetic EngineeringResearch P用默希e炒船热辨淖您R卵镭兽岛嘛耕皿抽心ingVaccines Against African Swine Fever VirusMA Xingshu* 9 SONGJinxiang(Molecular Biology Lc，。%、力咋沙* Sc沿MkA尸涝d Engineering College ,(Mcleci。原必咽耳牯*4畔涝右用泌应南欧单刷此酸等您阳瓦母College ,Hebei University of Engineering , Ha nd a n 056021, Ch i na)Abstract： African swine fever （ASF）is an acute,hemorrhagic and highly contagious tiboviral dis-N翳的6i相拓叩谊部&甚囹房浏他i混赐雄眼蛔闻欢甜 M.甲施威&哽眦冲s诞鸵丽储-asai油hw南 Mi挹&舶i恨h1费职&搭赤出阁削洒如罹用G志灿新没村也曲8凿戏曲g岛讯氾叫仙山牌8拈加$牍腮曲心丽笊用扉世“瞄史境ksw依！目的曲观&即拈妁叩辟沾眇。 坎wMw应甘d潮的地曲iilffi龄神映虹嫌&1&16少幽膈2湍。洲、好醐由界洗SS斓fr魏苗以the 洲理卜她危牌汩*1也抬giiR尊祐义沮扑威甫成岛1”猊卜袈阮志激诂时出施融6喝*&能 RW俪做出匕讪2斑 。双邮iU?iVi府浦R?理Bi波花8故出映 鲜前监喝加3皿阁绑地故器尚（的 棚幽腮Qi湖洲知MRlsff4加燧8由N0&W牌肮C1EIN崩服8尚炭啊隔说雎d就服丛性仲enualed 咿衅。昴检的常tfe&iYH舵e*0ti削阳改足团虫甘祝&肖谜1 Wi葛足古监姑&丫8朋住dcvel宾珂%W祐对的笛如风防部政口以冶邸快卵引叫58恍8成萄6出就烈括麻1胞&阂做e genetic Kev. words： African swine fever virus ( ASFV) ； apoptosis； autophagy； immune response； genetic eng i neer i ng vacc i nes1 1 c1engineering vaccines猪瘟眉6养猪业构陇的朔1日时 觑收稿曰期2019-02-19蕈禽垩曷:粼辕差成研发计划项（18226619D）- 嘈卖帽&帮景|跳*普琴?博吉，教授主要从事动物传染病防治及病原微生物分子生物学的教学与研究工作通 ,鸟兴w H-mail: maxingsnu 1%. com基畜作善简介:鸟兴褶（1963-）.男.河北张彖口人.博士.教授，主要从事动物传染病防治及病原微生物分子生物学的教学与研究工作* 通信 马兴树，E mail：maxingshu 126. com非洲猪瘟（African swine fever, ASF）曾被称为 非洲揩燃璧林Ah*泄而Afrf幽He, A#坂）期瞬痛 （网磷修撕虹眼PWHO）或豪哥玛荣蜻I词ilill疝 & WMhpgo&ir弟，星由非洲猪瘟病毒（屈fre 如辎祢布5邮诜加底轩妙祖15的;电急tfc can swine fever virus, ASFV）引起猪的一种急性、 出血性高度接触性脾传病毒病可致家猪网状内皮 案统慌血;J魂槎翠f星源世界彝猎亚健廉发暖痕典 董能借案瘢既明亡率，情窣尊业界养伟曲健康罪洲（感瓣前尚无防控本睇有皴的商亚膈 在威胁已 不容小觑。尽管目前尚无防控本病有效的商业化疫 in southern AfricaLJ_. 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FV睁朗琳赣龄(V尚;展病锹异站炼质知限本 (Borrelia dutttmi)的短端粒序列相似，且传播AS-EV 的非洲钝缘软 COniithodoros moubata )亦是此蛔脚融幌介.M两朝能存征遗传信息的燃 融 摩球t瀛后疏螺蜩椭枣敷v麴81 组血星截每目嗣尚床妨见两者存荏类似的基因机 因困it琉瞌螺旋体在湘PMt幡止的作用尚需进一空 研究。20119年、Chg等囚通埋小眠NA麻列分桥. A绵乍布缶的麟测到ASFV炫展嘛诞家辗盾 艳侔2.版啊我可藉明鹰JR玲部汉涯=步旃展孑 腌禅畚羊、钥翊镰徭时麟橱。斜瓣精髀觥秩舟移瑟、舟朦停枣母卵朦眉.，桀瓣箱稀霄将于屉诲牌辅月龟耨英 瑟瑟F嵋桐瘾葬学博翻屈叫券粮瓣李叫如瑟暖麟酬.攫毓瑟瑟暮良 熊明碑g洲翩脚襁格哄巍饵锥翘哪质膜A, Diagram of extracellular ASFV virions showing nucleoid, inner core shell internal membrane, capsid and outer en- A. Diagram of extracellular ASFV virions showing nucleoid.inner core shell,internal membrane.capsid and outer envelope B EM image of extracellular virions,black arrow shows the outer envelope,white arrow shows the capsid： C, yelope; B. EM. image olexiriK：elhihir virions .black arroxy *;hows the outer envelqpjt!. white arrow shows the capsid ;C. EM image of intracellular virions,IM shows immature vinon,M shows mature virion,Black arrow shows capsid pro- EM inuige of intracellular virions. IM shows iinnKit.ure virion. M shows mature virion.Black arrow shows cqpsicf protein, white arrow shows virus membrane D, EM image of intracellular virions, black arrow shows capsid protein, tein. white arrow shows virus membrane； 1). EM image of intracellul25 kb1522 25 kb37 ntLoop4蛋白质L4 蓊曹有至少54种结构蛋白和100多种感染 性病藤0结魅螯舀哥解麝出燧号桌和倘星 能勘粕因系珊爹业融兼答酶撮藻召触、噂 瞥酸转檄酶种蜡瞄股细蹄世。习a聚合独i浦 偷曲依t移盼址咐敝拥W 阕也绝榔蟹白包痞刊 位匠外膜 即岫(反心仍陟)】如t fife靖榕艇if PJi: 。瑜 氏插和雌(Mto勺衣壳(qg哦H伽i庙飓衣春镇虫p(934ie p朋冷(P易捋阡)秘眇展啜邛玺何下宓隔如响:)e、n御 I向凯的彳曲威、沸呼灰胰R%粉更 赛楠寿丽巍I斗岬蝙晔知种结构H p!50. p37.pl4 和 p34 的 220 ku = 锦矗堪型融翻蟹况麟勰御6我曜 白 pl50、p37、pi4 和 p34 的 220 ku 蛋白(pC2475L),(PCP53OR)io* ;/2 种 DNA 连接蛋白 plO(pA78R) 锥源蛤晶拓乾虺海疫翰磕旗操荏晰涝 如I b刖 仲1?怛妙uth顷 林蜘电祥 阴独彳制q慎中 如plsHU网和跳1溯k为非结构蛋俐。1).此外J6B&)2fe pBU9L和)R72衣壳为非结构病毒所需的1 限险1种最近帝国常臻n装将毒所需僭I学魅滴 曜拆了 AS璧迎NE涂邮国洞牌洲海食 耕轴缩构琨布氐.0述搀瘢鹫率摘瞬合羯催腹腐 物衲责弟脾以耕用弛豚蜩椭制罹底 物舵函物琳洋碘朝脚岸短军陶斗以株通路蛋 内相翩堀喉苗研制提供了结构基础。5璧期弯着静一吞噬细胞系统的细胞中复制, 苞括暨褪算瞄曜慝尾 爵邮膏微罄薯鼬赫1燃 用(endocy tosis)不口 巨胸 uX(macropinocy tosis)班人 (claihrin)齐岛弄7衣籁肩品虫白(aynamin)耐芮吞作被裂解为2种结构蛋白p35和p!5的62 ku蛋白 用(endocytosis)和巨胞饮(rnacropinocytosis)进入b及霆厕程糠,偷我蝮1展细胞.，痛后蛟魁酬通路脱壳。病毒的脱壳甫赖 于浦丰困子养荏眺佳眼肉体睡裂解衣毒,衣宛峰解 如膜角品痢毒蕊辨标葬、擀S葵素噩白单 警瞬咿匏咿搞g期 奔京斛。癖霄糜刷#Wi组装 闸德甲？ 国（睥袖蚣1囹F W用顷做林卯*间的）避行.，谶S后与徵 售号造槌镀醐为靠宣|Qn棉柚g）席加校温i由订 fteifl曲脸W撤禽转遇趣醐瞬毒麟赣有骤神 知J蛋啊以出芽的方式楝隅祝Inner enl8R55e envelopeOuter e&l 如 e envelopeCapsidCapsidCore jter shel 1P72 昭20RP72 卿 馋羽8R 月隆48RP12pp220 pp220Nucleoid NucleoidplO pACWL pA104LP35P15 I pS273R PS273R图4 ASFV的主要蛋白&1 盟4麻墙盖蓄黑耳 ASFV&l- Fig. 4 Major proteins of ASFVr，,Endoc EndocytosisVnamin DynaminTransport TransportEarly endosome Early endosomeViral l&Q 知ly factor、 eBudding BuddingUncoating toting -Naked coreI -ClathrinMacropinocytosisMacropinocytosisViral /gtnoineMultivesicular late endosome Multivesicular late endosome Capsid disassembly H+ Capsid disassembly H*Fusion抄。ri麟55的感染瓶期部V&3Fig. 5 Infectious cycle of ASFV ”l. Bad、Bmf、Bik、Puma 和 DP5C16 ASFV A224L基因编码细胞凋亡抑制剂 家族成员IAP蛋白，可抑制半胱基酸蛋白酶的 活化并促进细胞存活。病毒IAP不仅可阻止半胱 氨酸蛋白酶-3的活化，也能激活有趣的 是,病毒也编码一种干扰NF-kB活化的I kB类分 子(A238L)。A238L 和 A224L 在 ASFV 感染的不 同时期均有表达，提示ASFV在感染早期需要低活 性NF-kB以防止产生免疫应答，而在晚期因细胞系 统紊乱那么需要高活性的NF-kB以阻止细胞凋亡。 ASFV感染后期，受染细胞呈现凋亡，并显示细胞程 序性死亡的特征形态变化，如受染细胞出现典型的 膜空泡化并形成大员含有病毒的空泡，此更利于病 毒的扩散口七1.7 ASFV与自噬自噬(autophagy)是细胞实现自身代谢需要和 某些细胞器更新及清除细胞内病原体的一种细胞防 御机制，在先天性免疫和适应性免疫中具有重要作 用5】。ASFV已建立了控制阻止新组装病毒粒子 降解的这种机制，某些条件下自噬促进了病毒的增 殖。ASFV Bcl2的同系物A179L与促细胞凋亡 Bcl2家族蛋白互作抑制细胞凋亡，同时通过BH3 同源区域与Beclinl互作抑制细胞自噬。事实上， ASFV DP71L抑制了能激活PP1/蛋白磷酸酶1的 内质网应激反响2 ASFV的免疫应答说明ASFV保护性免疫应答的机制是研发 ASF疫苗的关键，但目前知之甚少。然而，感染猪 康复后可抵御某些毒株攻毒，说明这些猪产生了保 护性免疫应答。ASFV感染以严重的免疫抑制、 细胞凋亡、主要在单核细胞和巨噬细胞中复制为特 征。活化的巨噬细胞释放IL-1JL-6和TNF-a,引 起急性期反响、炎症、内皮细胞活化及细胞凋亡。 所有ASFV毒株具有相似的细胞嗜性和组织分布， 组织损伤的严重程度与毒株的毒力强弱有关。中和 抗体、CD8+ T细胞和自然杀伤细胞在ASFV免疫 应答中发挥重要作用。体外试羚说明，某些细胞机 制受ASFV编码的特异调控基因及病毒与细胞蛋 白互作的调控，但对感染后细胞功能有哪些改变仍 不清楚。蛋白质组学分析说明，ASFV关闭了约65% 的细胞蛋白的合成，而特异性细胞蛋白那么过量表达, 主要涉及氧化还原平衡、程序性细胞死亡及凝固23】 2. 1 ASFV的免疫逃逸ASFV的靶细胞主要为巨噬细胞，故巨噬细胞 在活化和协调病毒感染的免疫应答中具有极为重要 的作用。ASFV通过不同机制逃逸宿主先天和固有 的免疫防御系统，如I型干扰素(IFN)应答、细胞凋 亡、炎症反响及特异靶基因的活化鉴定这些基 因及其相关蛋白是理解病毒宿主相互关系及设计有 效弱毒疫苗的基础。“逃逸宿主”基因如非必需的 A238Lp通过抑制宿主转录因子阻止宿主免疫应答 基因的转录活化。某些病毒蛋白在病毒感染早 期可调控和抑制程序性细胞死亡途径，如促进病毒 复制和子代病毒产生的非必需蛋白A179Lp、Bcl2 家族成员、A224Lp、细胞凋亡家族成员抑制剂 (IAP)及C型凝集素EP153Rp等。相反，其他必需 蛋白如结构蛋白P54/E183Lp在病毒感染晚期诱导 细胞凋亡以调控病毒粒子产生与释放。DP71Lp蛋 白募集去磷酸转化起始因子eIF2的蛋白磷酸酶1 并恢复球蛋白的合成。多基因家族(MGF)360和 505基因及J329L、K205R和A276R基因编码的蛋 白可抑制诱导IFN产生网。l329Lp蛋白是位于宿 主细胞膜外表的糖蛋白，也是第一个被证明通过 Toll样受体3(TLR3)信号途径抑制IFN应答的 ASFV蛋白。位于细胞浆的K205Rp传白可抑制 IFN-B的活化。此外，A276Rp蛋白也是IFN-a (3活 化的抑制剂。抑制IFN-a 活化的结果导致数以百 计的IFN活化基因被抑制。D96Rp或称UK蛋白 也是一个潜在的免疫逃逸基因，虽然其作用机制不 明S其他调控蛋白如位于细胞外病毒粒子外表 的血凝素CD2v/E402Rp蛋白可抑制淋巴细胞的 活化网。2.2 ASFV的体液免疫鉴定产生ASFV抗体介导的中和或消除作用 的病毒靶蛋白仍需深入研究。细胞内成熟的病毒粒 子、细胞外我膜感染病毒粒子及受染细胞外表的病 毒蛋白有望成为抗体介导保护的重要靶蛋白，如 p72/pB646L、p54/pE183L 和 p30/pCP204L。抗 P72/pB646L和p54/pE183L的抗休可抑制病毒结 合细胞，而抗p30/pCP204L那么抑制病毒内化。其他 病毒表位蛋白可阻止病毒穿入或扩散，如CD2v/ pE402R、pl2/pO61R 及 D117L 蛋白等。目前, 通过对感染强毒而存活的家猪血清通过病毒表达文 库进行筛选，已鉴定出14种具有局部保护作用的血 清学免疫决定簇（serological immunodeterminants）, 即 病 毒蛋白 pB602L、pC44L、pCP312R、 pE183L、pK145R 和 pK2O5R；结构蛋白 pA104R、 pl0/pK78R、p30/pCP204L、p54/pE183L 和 p72/ PB646L；非结构蛋白核糖核昔酸还原酶（pF334L和 pF778R）、DNA连接酶（pNP419L）及胸昔激酶 （pK169R）网。体内和体外研究结果均说明，抗体的潜在保护 作用可能是通过另外的机制如补体介导细胞溶解或 抗体依赖细胞介导细胞毒（ADCC）作用完成的。有 趣的是，血清中存在的血吸附（HAD）抑制抗体能抑 制体外ASFV的感染并可在体内局部保护ASFV 的攻毒。事实上，在ASFV呈地方流行的莫桑比克 北部，发现家猪携带高水平的循环抗体，收集本地母 猪及其仔猪进行试验攻毒以确定对ASFV的遗传 抗性，结果说明，仔猪极度易感，故认为母猪群对 ASFV的抗性是不遗传的，其原因可能是：猪群在 暴露强毒株之前接触了抗原性类似的低毒力株； 母源抗体抵抗；亚致死性感染对随后的攻毒产 生了免疫网。对中和抗体作用的评估结果并不一致。Onisk 等：通过家猪被动转移试验发现，接受抗ASFV IgG的猪攻毒后85%存活，而未免疫对照猪存活为 0;接受抗体转移的猪病毒血症延迟和降低，除短暂 发烧外，其他临床表现正常。已鉴定的病毒中和表 位为3种衣壳蛋白p30、p54和p72,用杆状病毒表 达其中一种蛋白在同源病毒攻毒前免疫家猪，发现 免疫猪推迟2 d发病和病毒血症降低，但对发病、病 程或结局无效。故认为针对这些蛋白的中和抗 体缺乏以产生抗体介导保护，说明保护性免疫应答 除抗休外还涉及细胞免疫机制。2.3 ASFV的细胞免疫由于宿主和宿主细胞特异性的影响，对ASFV 细胞免疫应答的研究受到限制。ASFV在体内具有 高度的品种专一性，尽管其在体外可适应其他动物 细胞系生长，但对猪的毒力通常会降低。因此，准确 评估ASFV的细胞免疫应答的试验必须在家猪上 进行。鉴于强毒力ASFV感染后很快致猪死亡，故 免疫学研究使用的毒株为中等毒力或无毒力毒株 （如Malta78）,或无血吸附能力的无毒力株（如NH/ P68、OURT88/3）,或通过组织培养传代局部致弱 的毒株（如E75a）o用上述毒株接种存活的猪可对 同源或密切相关的强毒株攻毒提供保护。无毒力 ASFV感染的无临床病症的猪，自然杀伤（NK）细胞 活性提高，说明NK细胞对ASFV的免疫具有重要 作用逆。Oura等3研究说明，特异性CD8+T细 胞特别是CD8j3+ T细胞在ASFV感染的免疫保护 应答中发挥关键作用。DNA免疫猪尽管缺乏特异 性抗体，但诱导产生了抗CD2v（血凝素）的特异性 CD8+T细胞，使其获得了局部保护网。鉴定与 ASFV保护相关的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表 位由于T细胞群的异质性而变得更为复杂36】。除 CD8+T细胞外，其他T细胞亚群及NK细胞甚至 先夭免疫系统中的其他细胞可能也具有重要保护功 能。因此，阙明其在ASFV感染中的作用将是研发 最正确亚单位疫苗的重要内容。3基因工程疫苗非洲猪瘟疫苗的研发遇到了巨大挑战，截止目 前尚无有效的商业化疫