非洲猪瘟病毒免疫及基因工程疫苗研究进展.docx

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解纬^常43训％函估71-7236. 2函尊柄昭曾：A开放科学（资源服务）标识码（OSID）： +
Doi： 10. 16431/ki. 1671-7236.2019. 11.031开放科学（资源服务）标识码（OSID）：号
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Research Progress on Immune Response and Genetic Engineering
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Vaccines Against African Swine Fever Virus
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(Molecular Biology Lc，。%、力咋沙* Sc沿｝MkA尸涝d Engineering College ,
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Hebei University of Engineering , Ha nd a n 056021, Ch i na)
Abstract： African swine fever （ASF）is an acute,hemorrhagic and highly contagious tiboviral dis-
N翳的6i相拓叩谊部&甚囹房浏他i混赐雄眼蛔闻欢甜 M.甲施威&哽眦冲s诞鸵丽储§-
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engineering vaccines
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收稿曰期2019-02-19
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- 嘈卖帽&帮景|跳*普琴?△"博吉，教授'主要从事动物传染病防治及病原微生物分子生物学的教学与研究工作通 ,,鸟兴w H-mail: maxingsnu@ 1%. com
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作善简介:鸟兴褶（1963-）.男.河北张彖口人.博士.教授，主要从事动物传染病防治及病原微生物分子生物学的教学与研究工作
* 通信 马兴树，E mail：maxingshu@ 126. com

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）曾被称为 非洲揩燃璧林Ah*泄而"Afrf幽He, A#坂）期瞬痛 （网磷修撕虹眼PWHO）或豪哥玛荣蜻I词ilill疝 & WM^h<pgo&ir弟，星由非洲猪瘟病毒（屈fre 如辎祢布5邮\诜加底轩妙祖1^5®的;电急tfc can swine fever virus, ASFV）引起猪的一种急性、 出血性'高度接触性脾传病毒病'可致家猪网状内皮 案统慌血;J魂槎翠f星源世界彝猎亚健廉发暖痕典 董能借案瘢既明亡率，情窣尊业界养伟曲健康罪洲（［感瓣前尚无防控本睇有皴的商亚膈 在威胁已 不容小觑。尽管目前尚无防控本病有效的商业化疫 in southern AfricaLJ_. Scientific and Technical Review of the Office International des Epizooties ( Paris) ♦ 2004,23(3):965-977.
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(责任编辑晋大鹏)茵-但附ASF椭角瘢磁碳碱5程瘫斓究依 然取得了伺洪辰。i琢被醐寸的即瞬解'、龟寝 应籥褊煜葛特园甬碑麟融捋'综 述.屈㈱耕卒病购帏瓣襁福僻磨监0已痛毒蒋桂
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Fig. 1 Venn diagram representing c(M)rtliol<>gotis genes from ASFV,Faustoviruses,Kaum(»ebaviriis and Pacmanvirus-'-
X.2形态结构1.2部态编虞直径70~ 100 nm的核蛋白芯髓 (拟核赫Iv含有|旗层包裹、］核衣席转板康倍腿榭 (蹄枳亦祖均，痛成被砌、】fW■粒麟享稼 沟旦烈卯有昨有含P最混凌熊猝痹制睇等凭 为"i斜.甲炭第处影^莫陂帛裳餐解肉糠即
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A, Diagram of extracellular ASFV virions showing nucleoid, inner core shell internal membrane, capsid and outer en- A. Diagram of extracellular ASFV virions showing nucleoid.inner core shell,internal membrane.capsid and outer envelope B EM image of extracellular virions,black arrow shows the outer envelope,white arrow shows the capsid： C, yelope; B. EM. image olexiriK：elhihir virions ..black arroxy *;hows the outer envelqpjt!. white arrow shows the capsid ;C. EM image of intracellular virions,IM shows immature vinon,M shows mature virion,Black arrow shows capsid pro- EM inuige of intracellular virions. IM shows iinnKit.ure virion. M shows mature virion.Black arrow shows cqpsicf protein, white arrow shows virus membrane D, EM image of intracellular virions, black arrow shows capsid protein, tein. white arrow shows virus membrane； 1). EM image of intracellul<»r virions, black arrow shows capsid protein, white arrow shows virus membrane white arrow shows virus membrane
Fig. 2 African swine fever virus Fig. 2 African swine lever virus

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图3 ASFV基因组模式图胃日3成龄口莓用耕藉me Fig. 3 Diagram of ASFV genome
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170〜194 kb
V2
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(PCP53OR)io* ;/2 种 DNA 连接蛋白 plO(pA78R) 锥源蛤晶拓乾虺海疫翰磕旗操荏晰涝 如I b刖 仲1?怛妙uth顷 林蜘电祥 阴独彳制q慎中 如plsHU网和跳1溯k为非结构蛋俐。1).此外J6B&)2fe pBU9L和])R72衣壳为非结构病毒所需的1 限险1种最近帝国常臻n装将毒所需僭I学魅滴 曜拆了 AS璧迎NE涂邮国洞牌洲海食 耕轴缩构§琨布氐.0述搀瘢鹫率摘瞬合羯催腹腐 物衲责弟脾以耕用弛豚蜩椭制罹底 物舵函物琳洋碘朝脚岸短军陶斗以株通路蛋 内相翩堀喉苗研制提供了结构基础⑵。
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CapsidCapsid
Core jter shel 1P72 昭20R
P72 卿 馋羽8R 月隆48RP12
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plO pACWL pA104LP35
P15 I pS273R PS273R

图4 ASFV的主要蛋白&1・ 盟4麻墙盖蓄黑耳 ASFV&l- Fig. 4 Major proteins of ASFVr，,]

Endoc EndocytosisV^namin Dynamin
Transport TransportEarly endosome Early endosome
Viral l&Q 知ly factor、 eBudding Budding
Uncoating toting -Naked ■ coreI -Clathrin
MacropinocytosisMacropinocytosis
Viral /
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Multivesicular late endosome Multivesicular late endosome Capsid disassembly H+ Capsid disassembly H*Fusion
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麟55的感染瓶期部V&3
Fig. 5 Infectious cycle of ASFV ”
l.<» ASFV与细胞凋亡1・6壤脂城瓣涸）右sis）是为更好地适应生存环 细胞凋亡（apoptosis）是为更好地适应生存环 境、维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的 埋涮解触就唐懑蛔程先夬细胞 主动死亡过程.也是阻止病毒感染的重要先天细胞 机制，反过来，多数病毒具有抑制或延迟细胞应答的 这种机制［14］0 ASFVA179L基因编码一种抗细胞 凋亡Bcl2蛋白的同系物，以延长宿主细胞存活直至 病毒基因组的复制完成病毒Bcl2在感染早期 和晚期均可表达，并能抑制数种只含BH3区域的促 凋亡蛋白一称之为“快速细胞凋亡诱导物(rapid inducers of apoptosis的活化，如活化的 Bid、 BimLx BimS、BimEL> Bad、Bmf、Bik、Puma 和 DP5C16］ ° ASFV A224L基因编码细胞凋亡抑制剂 家族成员——IAP蛋白，可抑制半胱基酸蛋白酶的 活化并促进细胞存活。病毒IAP不仅可阻止半胱 氨酸蛋白酶-3的活化，也能激活有趣的 是,病毒也编码一种干扰NF-kB活化的I kB类分 子(A238L)。A238L 和 A224L 在 ASFV 感染的不 同时期均有表达，提示ASFV在感染早期需要低活 性NF-kB以防止产生免疫应答，而在晚期因细胞系 统紊乱那么需要高活性的NF-kB以阻止细胞凋亡。 ASFV感染后期，受染细胞呈现凋亡，并显示细胞程 序性死亡的特征形态变化，如受染细胞出现典型的 膜空泡化并形成大员含有病毒的空泡，此更利于病 毒的扩散口七
1.7 ASFV与自噬
自噬(autophagy)是细胞实现自身代谢需要和 某些细胞器更新及清除细胞内病原体的一种细胞防 御机制，在先天性免疫和适应性免疫中具有重要作 用5】。ASFV已建立了控制阻止新组装病毒粒子 降解的这种机制，某些条件下自噬促进了病毒的增 殖。ASFV Bcl2的同系物A179L与促细胞凋亡 Bcl2家族蛋白互作抑制细胞凋亡，同时通过BH3 同源区域与Beclinl互作抑制细胞自噬。事实上， ASFV DP71L抑制了能激活PP1/蛋白磷酸酶1的 内质网应激反响2 ASFV的免疫应答
说明ASFV保护性免疫应答的机制是研发 ASF疫苗的关键，但目前知之甚少。然而，感染猪 康复后可抵御某些毒株攻毒，说明这些猪产生了保 护性免疫应答⑵］。ASFV感染以严重的免疫抑制、 细胞凋亡、主要在单核细胞和巨噬细胞中复制为特 征。活化的巨噬细胞释放IL-1JL-6和TNF-a,引 起急性期反响、炎症、内皮细胞活化及细胞凋亡㈤。 所有ASFV毒株具有相似的细胞嗜性和组织分布， 组织损伤的严重程度与毒株的毒力强弱有关。中和 抗体、CD8+ T细胞和自然杀伤细胞在ASFV免疫 应答中发挥重要作用。体外试羚说明，某些细胞机 制受ASFV编码的特异调控基因及病毒与细胞蛋 白互作的调控，但对感染后细胞功能有哪些改变仍 不清楚。蛋白质组学分析说明，ASFV关闭了约65% 的细胞蛋白的合成，而特异性细胞蛋白那么过量表达, 主要涉及氧化还原平衡、程序性细胞死亡及凝固［23】° 2. 1 ASFV的免疫逃逸
ASFV的靶细胞主要为巨噬细胞，故巨噬细胞 在活化和协调病毒感染的免疫应答中具有极为重要 的作用。ASFV通过不同机制逃逸宿主先天和固有 的免疫防御系统，如I型干扰素(IFN)应答、细胞凋 亡、炎症反响及特异靶基因的活化鉴定这些基 因及其相关蛋白是理解病毒宿主相互关系及设计有 效弱毒疫苗的基础。“逃逸宿主”基因如非必需的 A238Lp通过抑制宿主转录因子阻止宿主免疫应答 基因的转录活化。某些病毒蛋白在病毒感染早 期可调控和抑制程序性细胞死亡途径，如促进病毒 复制和子代病毒产生的非必需蛋白A179Lp、Bcl2 家族成员、A224Lp、细胞凋亡家族成员抑制剂 (IAP)及C型凝集素EP153Rp等。相反，其他必需 蛋白如结构蛋白P54/E183Lp在病毒感染晚期诱导 细胞凋亡以调控病毒粒子产生与释放。DP71Lp蛋 白募集去磷酸转化起始因子eIF2的蛋白磷酸酶1 并恢复球蛋白的合成。多基因家族(MGF)360和 505基因及J329L、K205R和A276R基因编码的蛋 白可抑制诱导IFN产生网。l329Lp蛋白是位于宿 主细胞膜外表的糖蛋白，也是第一个被证明通过 Toll样受体3(TLR3)信号途径抑制IFN应答的 ASFV蛋白。位于细胞浆的K205Rp传白可抑制 IFN-B的活化。此外，A276Rp蛋白也是IFN-a (3活 化的抑制剂。抑制IFN-a 活化的结果导致数以百 计的IFN活化基因被抑制。D96Rp或称UK蛋白 也是一个潜在的免疫逃逸基因，虽然其作用机制不 明S'其他调控蛋白如位于细胞外病毒粒子外表 的血凝素CD2v/E402Rp蛋白可抑制淋巴细胞的 活化网。
2.2 ASFV的体液免疫
鉴定产生ASFV抗体介导的中和或消除作用 的病毒靶蛋白仍需深入研究。细胞内成熟的病毒粒 子、细胞外我膜感染病毒粒子及受染细胞外表的病 毒蛋白有望成为抗体介导保护的重要靶蛋白，如 p72/pB646L、p54/pE183L 和 p30/pCP204L。抗 P72/pB646L和p54/pE183L的抗休可抑制病毒结 合细胞，而抗p30/pCP204L那么抑制病毒内化。其他 病毒表位蛋白可阻止病毒穿入或扩散，如CD2v/ pE402R、pl2/pO61R 及 D117L 蛋白等㈣。目前, 通过对感染强毒而存活的家猪血清通过病毒表达文 库进行筛选，已鉴定出14种具有局部保护作用的血 清学免疫决定簇（serological immunodeterminants）, 即 病 毒蛋白 pB602L、pC44L、pCP312R、 pE183L、pK145R 和 pK2O5R；结构蛋白 pA104R、 pl0/pK78R、p30/pCP204L、p54/pE183L 和 p72/ PB646L；非结构蛋白核糖核昔酸还原酶（pF334L和 pF778R）、DNA连接酶（pNP419L）及胸昔激酶 （pK169R）网。
体内和体外研究结果均说明，抗体的潜在保护 作用可能是通过另外的机制如补体介导细胞溶解或 抗体依赖细胞介导细胞毒（ADCC）作用完成的。有 趣的是，血清中存在的血吸附（HAD）抑制抗体能抑 制体外ASFV的感染并可在体内局部保护ASFV 的攻毒。事实上，在ASFV呈地方流行的莫桑比克 北部，发现家猪携带高水平的循环抗体，收集本地母 猪及其仔猪进行试验攻毒以确定对ASFV的遗传 抗性，结果说明，仔猪极度易感，故认为母猪群对 ASFV的抗性是不遗传的，其原因可能是：①猪群在 暴露强毒株之前接触了抗原性类似的低毒力株； ②母源抗体抵抗；③亚致死性感染对随后的攻毒产 生了免疫网。
对中和抗体作用的评估结果并不一致。Onisk 等⑶：通过家猪被动转移试验发现，接受抗ASFV IgG的猪攻毒后85%存活，而未免疫对照猪存活为 0;接受抗体转移的猪病毒血症延迟和降低，除短暂 发烧外，其他临床表现正常。已鉴定的病毒中和表 位为3种衣壳蛋白p30、p54和p72,用杆状病毒表 达其中一种蛋白在同源病毒攻毒前免疫家猪，发现 免疫猪推迟2 d发病和病毒血症降低，但对发病、病 程或结局无效⑶］。故认为针对这些蛋白的中和抗 体缺乏以产生抗体介导保护，说明保护性免疫应答 除抗休外还涉及细胞免疫机制。
2.3 ASFV的细胞免疫
由于宿主和宿主细胞特异性的影响，对ASFV 细胞免疫应答的研究受到限制。ASFV在体内具有 高度的品种专一性，尽管其在体外可适应其他动物 细胞系生长，但对猪的毒力通常会降低。因此，准确 评估ASFV的细胞免疫应答的试验必须在家猪上 进行。鉴于强毒力ASFV感染后很快致猪死亡，故 免疫学研究使用的毒株为中等毒力或无毒力毒株 （如Malta78）,或无血吸附能力的无毒力株（如NH/ P68、OURT88/3）,或通过组织培养传代局部致弱 的毒株（如E75a）o用上述毒株接种存活的猪可对 同源或密切相关的强毒株攻毒提供保护。无毒力 ASFV感染的无临床病症的猪，自然杀伤（NK）细胞 活性提高，说明NK细胞对ASFV的免疫具有重要 作用〔逆。Oura等3」研究说明，特异性CD8+T细 胞特别是CD8j3+ T细胞在ASFV感染的免疫保护 应答中发挥关键作用。DNA免疫猪尽管缺乏特异 性抗体，但诱导产生了抗CD2v（血凝素）的特异性 CD8+T细胞，使其获得了局部保护网。鉴定与 ASFV保护相关的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表 位由于T细胞群的异质性而变得更为复杂〔36】。除 CD8+T细胞外，其他T细胞亚群及NK细胞甚至 先夭免疫系统中的其他细胞可能也具有重要保护功 能。因此，阙明其在ASFV感染中的作用将是研发 最正确亚单位疫苗的重要内容。
3基因工程疫苗
非洲猪瘟疫苗的研发遇到了巨大挑战，截止目 前尚无有效的商业化疫