人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建.docx
《人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建.docx(12页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、人膀胱逼尿肌中肾上腺素能3受体基因的克隆及其载体的构建【摘要】 目的: 克隆人膀胱逼尿肌中肾上腺素能3受体基因全长,并构建其反义真核表达载体. 方法:采用RTPCR法从人膀胱逼尿肌中扩增出3AR的全长cDNA序列,上游引物5端加有BamHI及ClaI酶切位点,下游引物加有HindIII酶切位点,将该片段插入pUC18载体中,摇菌扩增后,用ClaI和HindIII切下目的基因,然后将目的片段反向插入逆转录病毒表达载体pLNCX上. 最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定. 结果:经琼脂糖凝胶鉴定,所克隆的目的基因大约为 kb,并成功地连接到逆转录病毒载体pLNCX上,经测序证明,插入的目
2、的片段其碱基序列与Genbank上报道的完全一致,且插入载体的方向完全正确. 结论:成功克隆了人逼尿肌中肾上腺素能3受体基因的全长cDNA序列和构建了其反义真核表达载体.【关键词】 受体; 肾上腺素能3; 载体0引言膀胱逼尿肌活动亢进是下尿路症状的常见原因. 研究发现,肾上腺素能受体亚型能够介导膀胱平滑肌松弛,对维持储尿过程中膀胱良好的顺应性起着关键作用1. 但何种AR亚型介导逼尿肌松弛,国内外学者还有一定的争论2-3. 为进一步探讨AR亚型在逼尿肌中功能奠定基础,我们拟采用反义基因技术,构建AR亚型的反义真核表达载体,封闭三种AR中的任意两个,得到表达单一亚型的细胞克隆,再进一步进行研究,以
3、确定AR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响,并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据.1材料和方法1材料人膀胱逼尿肌标本取自手术中因膀胱癌而行膀胱全切患者标本,取正常组织的膀胱平滑肌约1 g,迅速放入液氮中10 min,再放入-70冰箱中保存. pUC19购于Takara公司;逆转录病毒载体plncx购自Invitrogen公司;JM109大肠杆菌感受态菌株购自Takara公司. 限制性内切酶和DNA工具酶BamHI,HindIII,ClaI等内切酶购于华美生物有限公司;RNase和T4DNA连接酶购于Promega公司. Trizol试剂及RNA LA PCRTMKit(
4、AMV)购自大连宝生物公司;QiAquick Gel Extraction Kit购于Qiagen公司;质粒提取试剂盒购自Gibco公司.2方法人膀胱逼尿肌中2AR全长基因的克隆称取冰冻状态下的膀胱逼尿肌组织约200 mg,采用宝生物公司的Trizol试剂并按使用说明书操作提取总RNA,10 g/L低熔点琼脂糖凝胶鉴定RNA的含量及完整性. 根据Genebank提供的3AR基因序列采用软件设计如下两对引物,外引物及内引物,应用套式PCR来扩增目的基因. 内引物:上游引物F01: 5CCGGATC CATCGATATGGGGCAACCCGGGAACGG3, 下游引物R01: 5AGGAAGCTT
5、TTACAGCAGTGAGTCATTTG3; 外引物:上游引物F02: 5TGCGCTTACCTGCCAGACTG3, 下游引物R02: 5GCCCTTCCTTCTGCATATCTC3.其中内引物是针对蛋白质编码区设计的,其上游加有BamHI及ClaI酶切位点,下游加有HindIII位点,使其能反向连接在pLNCX的多克隆位点上. 外引物F02,R02可扩增AR cDNA第1941587 bp. 引物由大连宝生物公司合成. 取总RNA 1 L采用宝生物公司的RNA LA PCRTM Kit(AMV)试剂盒进行RTPCR反应. 取8 L扩增产物用1%琼脂糖凝胶跑电泳,并用BIORAD Flus凝
6、胶图像处理系统进行图像分析.2AR基因反义真核表达载体的构建PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶跑电泳除杂质,并用柱式PCR产物回收试剂盒回收. 回收产物与pUC18克隆载体分别用BamHI和HindIII酶切后在T4DNA连接酶的作用下16过夜连接. 取连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,涂布含有氨苄青霉素、IPIG和Xgal的平板,37过夜培养,挑取白色菌落并作标记,通过菌落PCR鉴定阳性重组克隆. 将含有阳性重组质粒的菌落挑入适量LB培养液中,37培养过夜,采用Gibco公司的质粒提取试剂盒制备质粒,一部分作BamHI+HindIII双酶切鉴定正确后将其命名为pUC3AR;一部分用Cla
7、I+HindIII双酶切后,10 g/L琼脂糖凝胶回收 kb目的基因;随后用ClaI+HindIII双酶切逆转录病毒载体plncx,并用Qiagen公司的QiAquick Gel Extraction Kit后回收plncx经酶切后所产生的载体片段,经T4DNA连接酶连接目的基因及载体片段,摇菌扩增,提取质粒后,用ClaI+HindIII双酶切进行电泳鉴定. 插入片段的碱基序列及其插入方向采用DNA测序方法进行鉴定. 鉴定正确后将3AR反义真核表达载体命名为pLNCX3AR.2结果目的基因克隆反转录产物经PCR扩增,10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示RTPCR结果与预期长度一致.3AR反义表达载体
8、的酶切鉴定其结果与理论设计完全相符.1: dl2000 marker; 2:3AR; 3: 阴性对照.图13AR目的基因产物的RTPCR检测1: dl2000 marker; 2:pLNCX3AR; 3:空白对照; 4:HindIII marker.图2pLNCX3AR反义表达载体的酶切鉴定3AR载体中目的基因的碱基序列及其插入方向测序结果显示我们所克隆进入plncx的目的片段其碱基序列与Genebank所提供的3AR的碱基序列完全一致,且插入方向完全正确,表明我们已经成功构建了人膀胱逼尿肌肾上腺素能3受体基因的反义真核表达载体:TGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTG
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 膀胱 逼尿肌中 肾上腺素 受体 基因 克隆 及其 载体 构建
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【快乐****生活】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【快乐****生活】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。