天丹降压方对自发性高血压肝阳上亢模型大鼠的影响_陶源.pdf

引用:陶源，胡旦，王国庆，卿媛媛，朱筱婧，颜旭天丹降压方对自发性高血压肝阳上亢模型大鼠的影响 J 湖南中医杂志，2023，39(1):163167.天丹降压方对自发性高血压肝阳上亢模型大鼠的影响陶源1，胡旦1，王国庆1，卿媛媛1，朱筱婧2，颜旭2(1.湖南中医药大学，湖南长沙，410208;2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南长沙，410006)摘要 目的:探讨天丹降压方对自发性高血压大鼠(SH)肝阳上亢证模型的影响。方法:将 60 只SH 随机分为 SH 对照组、SH 模型组、坎地沙坦酯组及天丹降压方低、中、高剂量组，每组各 10 只，另将10 只正常血压(WKY)大鼠设为空白对照组。空白对照组、SH 对照组予蒸馏水干预 12 周，其余组大鼠采用静脉推注参附注射液的方法制备肝阳上亢证模型。造模成功后进行相应药物干预，剂量均为 8 ml/kg，SH 模型组灌胃蒸馏水，连续 8 周。比较各组大鼠 24 h 饮水量、易激惹程度、眼结膜充血情况、痛阈感觉温度、收缩压、Toll 样受体 4(TL4)、核因子B(NFB)、白细胞介素6(IL6)及肿瘤坏死因子(TNF)等各项指标情况。结果:SH 各造模组的 24 h 饮水量、易激惹程度、眼结膜充血情况、痛阈感觉温度、收缩压造模前后组内比较，差异均有统计学意义(P0.01);造模后，SH 造模组的上述 5 项指标分别与空白对照组、SH 对照组比较，差异均有统计学意义(P0.01)。干预前，SH 对照组、SH 模型组及各药物组的收缩压与空白对照组比较，SH 模型组及各药物组的收缩压与 SH 对照组比较，差异均有统计学意义(P0.05);干预第 12、24、36、48、60 天，各药物组的收缩压与 SH 模型组比较，差异均有统计学意义(P0.05)。各组血浆TL4、NFB、IL6、TNF 含量比较，SH 模型组均高于空白对照组及 SH 对照组，各药物组均低于 SH 模型组，差异均有统计学意义(P0.01)。结论:天丹降压方对 SH 肝阳上亢证模型大鼠有明显的降压作用，并可降低其血浆 TL4、NFB、TNF、IL6 含量，其作用机制可能与干预 TL4/NFB 通路相关。关键词 自发性高血压大鼠;肝阳上亢证;天丹降压方;实验研究 中图分类号 285.5 文献标识码 ADOI:1016808/jcnkiissn10037705202301039基金项目:湖南省教育厅科研项目(18C0381);湖南省中医药研究院科研项目(201813)第一作者:陶源，女，2020 级硕士研究生，研究方向:中医药防治心血管疾病通信作者:颜旭，男，医学博士，主任医师，硕士研究生导师，研究方向:中医药防治心血管疾病，Email:朱筱婧，女，医学硕士，副主任医师，研究方向:中医药防治心血管疾病，Email:471499219 Effect of Tiandan Jiangya prescription on a rat model of spontaneous hypertensionwith syndrome of upper hyperactivity of liver YangTAO Yuan1，HU Dan1，WANG Guoqing1，QING Yuanyuan1，ZHU Xiaojing2，YAN Xu2(1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China;2.The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410006，Hunan，China)Abstract Objective:To investigate the effect of Tiandan Jiangya prescription on a spontaneously hypertensive rat(SH)model of syndrome of upper hyperactivity of liver Yang.Methods:A total of 60 SHs were randomly divided intoSH control group，SH model group，candesartan cilexetil group，and low，middle，and highdose Tiandan Jiangya pre-scription groups，with 10 rats in each group，and another 10 WKY rats with normal blood pressure were selected as blankcontrol group.The rats in the blank control group and the SH control group were given distilled water for 12 weeks，andthe rats in the other groups were given intravenous injection of Shenfu injection to establish a model of syndrome of upperhyperactivity of liver Yang.Corresponding drug intervention was given after successful modeling at a dose of 8 ml/kg，and361第 39 卷第 1 期2023 年 1 月HUNAN JOUNAL OF TADITIONAL CHINESE MEDICINEVol.39No.1Jan.2023the rats in the SH model group were given distilled water by gavage，for 8 consecutive weeks.The above groups were com-pared in terms of 24hour water consumption，degree of irritability，conjunctival hyperemia，pain threshold temperature，systolic pressure，Tolllike receptor 4(TL4)，nuclear factorkappa B(NFB)，interleukin6(IL6)，and tumor nec-rosis factor(TNF).esults:SH modeling groups had significant changes in 24hour water consumption，degree ofirritability，conjunctival hyperemia，pain threshold temperature，and systolic pressure after modeling(P0.01)，and aftermodeling，there were significant differences in these five indices between the SH modeling groups and the blank controlgroup，as well as between the SH modeling groups and the SH control group(P0.01).Before intervention，there was asignificant difference in systolic pressure between the blank control group and the other groups，as well as between the SHmodel group/the medication groups and the SH control group(P0.05)，and on days 12，24，36，48，and 60 of interven-tion，there was a significant difference in SH between the medication groups and the SH model group(P0.05).TheSH model group had significantly higher plasma levels of TL4，NFB，IL6，and TNF than the blank control groupand the SH control group，and the medication groups had significantly lower levels than the SH model group(P0.01).Conclusion:Tiandan Jiangya prescription has a significant antihypertensive effect on SH model of syndrome of upper hy-peractivity of liver Yang and can reduce the plasma levels of TL4，NFB，TNF，and IL6，possibly by intervening a-gainst the TL4/NFB signaling pathway.Keywords spontaneously hypertensive rat;syndrome of upper hyperactivity of liver yang;Tiandan Jiangya pre-scription;experimental study原发性高血压病的发病机制十分复杂，是一种以体循环动脉压增高为特征的常见心血管疾病，简称为高血压病1。天丹降压方是湖南省名老中医喻正科教授临床治疗高血压病肝阳上亢证的经验方，具有平肝潜阳、祛瘀化痰的作用。前期研究发现天丹降压方具有降压作用，并可以逆转高血压病左心室肥厚，保护靶器官，改善高血压病引起的头晕头痛等症状24。本实验将自发性高血压大鼠(SH)作为研究对象，构建肝阳上亢证模型，采用天丹降压方不同剂量进行干预，以探讨天丹降压方对 SH 大鼠肝阳上亢模型的影响及作用机制，为天丹降压方的临床应用提供实验依据。1实验材料1.1动物10 周龄 SPF 级雄性 SH 大鼠 60 只，体质量 250 280 g，SPF 级雄性正常血压 WistarKyoto(WKY)大鼠 10 只，均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证编号:SCXK(湘)20160002。1.2药物1)天丹降压方:天麻12 g，丹参12 g，鬼箭羽 10 g，钩藤 10 g，珍珠母 12 g，地龙 10 g，山楂10 g，益母草 10 g，陈皮 10 g，茯苓 10 g，葛根 10 g，夏枯草 10 g。上述中药购于湖南省中医药研究院附属医院，由湖南中医药大学科技创新中心制备。以上中药采用蒸馏水浸泡 30 min，煎煮 2 次。将2 次药液混合后过滤，用 80负压旋转蒸馏浓缩至药物浓度分别为 4、2、1 g/ml。2)坎地沙坦酯混悬液(浙江永宁药业股份有限公司，批准文号:国药准字 H20080183，批号:2007173，规格:8 mg/片)。取坎地沙坦酯 8 mg 在乳钵中研磨，用蒸馏水配制80 ml混悬液，浓度为0.1 mg/ml。3)参附注射液(雅安三九药业有限公司，批准文号:国药准字Z20043117，规格:10 ml/支)。取参附注射液 20 ml，以 0.9%氯化钠注射液 250 ml 配置，药物浓度为8 ml/kg，用于造模。1.3主要试剂与仪器SDSPAGE 电泳液(江苏碧云天生物技术研究所)，胎牛血清 Hyclone(美国 GE公司)，ECL 化学发光显色液(美国密理博公司)，4X蛋白上样缓冲液、4%多聚甲醛、高效 IPA 裂解液(北京 Solarbio 公司)。电子天平(长沙湘仪天平仪器厂)，电热恒温箱(天津泰斯特)，无创血压计(北京软隆生物技术有限公司)，SD 转膜仪(美国 BIOAD公司)，86超低温冰箱(美国热电 Thermo)，BM生物组织包埋机(湖北孝感宏业公司)，离心机(德国艾本德)，M223 切片机(德国 Leica 公司)。2实验方法2.1模型制备采用静脉推注参附注射液对 60 只SPF 级雄性 SH 大鼠进行造模。将取参附注射液20 ml，以 0.9%氯化钠注射液 250 ml 配置，药物浓度为 8 ml/kg，造模 4 周。通过观察大鼠易激惹程度、血压、痛阈、旋转时间、饮水量判断造模是否成功。2.2动物分组、造模及给药将 60 只 SH 大鼠随机分为 SH 对照组、SH 模型组、坎地沙坦酯组及4612023 年第 39 卷第 1 期(总第 287 期)天丹降压方低、中、高剂量组(简称为天丹低、中、高剂量组)，每组各 10 只。另将 10 只 WKY 大鼠设为空白对照组，共 7 组。空白对照组、SH 对照组均每天灌胃蒸馏水 8 ml/kg，连续 12 周;其余组大鼠均进行造模。从第 5 周开始，SH 模型组每天灌胃蒸馏水 8 ml/kg，连续 60 d;坎地沙坦酯组每天灌胃坎地沙坦酯混悬液 8 ml/kg(浓度为 0.1 mg/ml)，连续60 d;天丹低、中、高剂量组每天灌胃天丹降压方煎剂 8 ml/kg(浓度分别为 1、2、4 g/ml)，连续 60 d。2.3观察指标2.3.1一般情况观察大鼠外观、24 h 饮水量、易激惹程度、眼结膜充血情况、痛阈感觉温度。易激惹程度分级标准如下。级:抓持大鼠颈部，大鼠表现出尖叫、惊跳等行为;级:抓持大鼠颈部时，大鼠出现咬人行为;级:提住尾部时大鼠出现尖叫、惊跳等行为，甚至频繁打斗、互相撕咬。分别计为 0、1、2 分。2.3.2收缩压将大鼠置于加热的培养箱中5 min，于造模前 1 d，造模结束后第 1 天，造模成功后第 5 周起于给药后的 12、24、36、48、60 d，用无创血压计测量大鼠尾动脉的收缩压。重复测量 3 次，并取其平均值。2.3.3Toll 样受体 4(TL4)、核因子B(NFB)的表达采用 Western blot 检测各组大鼠干预前后TL4、NFB 的表达量。将大鼠血管内皮组织放入研钵中研磨，用研棒研磨组织，取样品50 mg、1 ml蛋白裂解液，10 l 苯甲基磺酰氟，12000 r/min 离心15 min，小心吸取上清液，分装在离心管中，置于80保存，提取血管内皮组织总蛋白。随后将牛血清白蛋白做为蛋白标准，进行血管内皮组织总蛋白定量，之后配置分离胶与浓缩胶，进行血管内皮组织蛋白电泳，并发光处理样品。电泳具体操作如下:上样量为 30 g，上样体积为 0.05 ml。跑电泳:80U 电压跑浓缩胶约 30 min，120U 跑分离胶约20 min。转膜:电泳结束后，切除加溴酚蓝下方、样孔以外和浓缩胶部分的胶后进行洗膜(置于摇床上，用 Tris HCl 缓 冲 盐 溶 液 进 行 3 次 洗 涤，10 min/次)。发光:将显影剂均匀铺满整个聚偏二氟乙烯膜上，盖上薄膜及胶片，将胶片马上放入显影液，时间大约 3 min 左右，清水漂洗下后放在定影液中，冲洗晾干。之后用 Image 图像分析软件进行蛋白定量分析，再用 Graphpad 8.0 进行数据分析。2.3.4白细胞介素6(IL6)、肿瘤坏死因子(TNF)水平采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组大鼠干预前后 IL6、TNF 的水平。所有试剂和组分恢复到室温，标准品、质控品和样品，做复孔。配制好试剂盒各种组分的工作液，按试剂盒说明书中试剂准备中描述的方法操作。2.4统计学方法运用 SPSS 21.0 进行统计分析，采用 Graphpad 8.0 软件进行绘图。计量资料采用均数标准差(xs)表示，2 组间比较采用 t 检验或校正 t 检验，多组数据处理采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD 法检验。P0.05 表示差异有统计学意义。3实验结果3.1各组大鼠造模前后各项指标比较SH 对照组、SH 各造模组 24 h 饮水量、痛阈感觉温度、收缩压以及 SH 各造模组易激惹程度、眼结膜充血情况造模前后组内比较，差异均有统计学意义(P 0.01);造模后，SH 各造模组的 5 项指标分别与空白对照组、SH 对照组比较，差异均有统计学意义(P0.01)，SH 对照组仅 24 h 饮水量、痛阈感觉温度、收缩压 3 项指标与空白对照组比较，差异有统计学意义(P0.01)，说明造模成功。(见表 14)表 1各组大鼠 24 h 饮水量比较(xs，ml)组别动物数/只造模前造模后空白对照组1020.24.238.51.0SH 对照组1022.33.240.60.7abSH 各造模组5023.53.942.80.9abc注:与本组造模前比较，aP 0.01;与空白对照组比较，bP0.01;与 SH 对照组造模后比较，cP0.01。表 2各组大鼠易激惹程度及眼结膜充血情况比较组别动物数/只易激惹程度造模前造模后眼结膜充血情况造模前造模后空白对照组101000100000SH 对照组101000100000SH 各造模组5048200050abc049abc注:与本组造模前比较，aP 0.01;与空白对照组比较，bP0.01;与 SH 对照组造模后比较，cP0.01。表 3各组大鼠痛阈感觉温度比较(xs，)组别动物数/只造模前造模后空白对照组1060.60.361.50.2SH 对照组1056.10.255.20.1abSH 各模型组5057.30.150.20.2abc注:与本组造模前比较，aP0.01;与空白对照组造模后比较，bP0.01;与 SH 对照组造模后比较，cP0.01。561第 1 期陶源，胡旦，王国庆，等:天丹降压方对自发性高血压肝阳上亢模型大鼠的影响表 4各组大鼠造模前后收缩压比较(xs，mmHg)组别动物数/只造模前造模后空白对照组10122.62.8123.23.6SH 对照组10153.32.7180.64.9abSH 各造模组50152.53.4187.59.2abc注:与本组造模前比较，aP0.01;与空白对照组造模后比较，bP0.01;与 SH 对照组造模后比较，cP0.01。3.2各组大鼠干预前后各项指标比较3.2.1各组大鼠干预前后收缩压比较干预前，SH 对照组、模型组及各药物组与空白对照组比较，模型组及各药物组与 SH 对照组比较，差异均有统计学意义(P0.05);干预第 12、24、36、48、60 天各药物组与 SH 模型组比较，差异均有统计学意义(P0.05)。(见表 5)表 5各组大鼠干预前后收缩压比较(xs，mmHg)组别动物数/只干预前干预第12天 干预第24天 干预第36天 干预第48天 干预第60天空白对照组10142.66.4144.67.5141.89.4136.95.7144.410.9 138.52.4SH对照组10174.32.6a175.28.2176.89.2176.86.7177.514.1 177.63.6SH模型组10180.42.7ab180.18.5183.79.2182.86.4183.414.2 182.43.6坎地沙坦酯组10180.74.3ab174.38.3c168.63.6c156.76.8c142.16.3c133.25.6c天丹低剂量组10182.95.9ab173.212.6c168.44.8c165.63.4c161.79.3c155.56.4c天丹中剂量组10181.36.2ab171.416.5c166.94.8c162.39.7c153.620.2c138.511.1c天丹高剂量组10183.713.5ab167.85.7c161.78.9c152.17.8c141.712.3c129.52.5c注:与空白对照组干预前比较，aP0.05;与 SH 对照组干预前比较，bP0.05;与 SH 模型组干预后比较，cP0.05。3.2.2各组大鼠干预前后 TL4、NFB 表达比较SH 模型组血浆中 TL4、NFB 含量高于空白对照组、SH 对照组，差异均有统计学意义(P0.01);各药物组血浆中 TL4、NFB 含量低于 SH 模型组，差异均有统计学意义(P0.01)。(见图 13)3.4各组大鼠干预前后 IL6、TNF 水平比较SH 模型组血浆中 IL6、TNF 含量高于空白对照组和 SH 对照组，差异均有统计学意义(P 0.01);各药物组血浆中 IL6、TNF 含量均低于SH 模型组，差异均有统计学意义(P0.01)。(图4、图 5)注:A空白对照组;BSH 对照组;CSH 模型组;D坎地沙坦酯组;E天丹低剂量组;F天丹中剂量组;G天丹高剂量组。图 1天丹降压方对 SH 肝阳上亢模型 TL4、NFB 表达的影响注:与空白对照组比较，aP0.01;与 SH 对照组比较，bP0.01;与 SH 模型组比较，cP0.01。图 2各组大鼠干预前后 TL4 表达比较注:与空白对照组比较，aP0.01;与 SH 对照组比较，bP0.01;与 SH 模型组比较，cP0.01。图 3各组大鼠干预前后 NFB 表达比较注:与空白对照组比较，aP0.01;与 SH 对照组比较，bP0.01;与 SH 模型组比较，cP0.01。图 4各组大鼠干预前后 IL6 水平比较6612023 年第 39 卷第 1 期(总第 287 期)注:与空白对照组比较，aP0.01;与 SH 对照组比较，bP0.01;与 SH 模型组比较，cP0.01。图 5各组大鼠干预前后 TNF 水平比较4讨论原发性高血压病在临床上常以头痛、头晕等症状为主，故中医学将其归属于“头痛”“眩晕”范畴5。本病可分为肝阳上亢、痰浊壅盛、阴虚阳亢及阴阳两虚 4 种证候，其中肝阳上亢证最为常见。天丹降压方由天麻、丹参、鬼箭羽、钩藤、珍珠母、地龙、山楂、益母草、陈皮、茯苓、葛根、夏枯草 12 味药物组成。方中天麻平肝潜阳，丹参活血祛瘀，为君药;鬼箭羽破血通经，钩藤平肝风，珍珠母清肝火，地龙息风通络，为臣药;山楂、益母草化瘀血利水道，陈皮燥湿化痰，茯苓利水祛痰浊，为佐药;葛根解肌通络，夏枯草清肝经之热，为使药。诸药配伍，使风阳潜，瘀血化，痰湿除，血脉畅，从而根除高血压病气、血、脉失调的病机根源。研究表明，炎症反应与原发性高血压病的发生、发展有着密切关系6。高血压病发作时，动脉压力升高冲击血管，促使炎症细胞在血管组织中浸润、合成和释放相关炎症因子，进而启动炎症过程;随后诱发全身血管系统持续性炎症反应，导致血管重构、血管内皮功能损伤等病理生理学改变，引起血压 进 一 步 升 高，诱 导 靶 器 官 损 伤78。而TL4/NFB通路是介导炎性内皮损伤引起高血压病发生发展的重要通路。TL4 受体结合配体激活NFB通路，上调一系列炎症因子(TNF、IL6等)，从而激活炎症反应，参与血管内皮的损伤、重构等，导致血压升高9。本研究选用参附注射液静脉推注造模，结果显示，与空白对照组、SH 对照组比较，SH 各造模组收缩压、24 h 饮水量、易激惹程度、眼结膜充血数均升高(P0.01)，痛阈感觉温度降低(P0.01)，说明造模成功。本实验研究结果显示，天丹降压方各剂量组和坎地沙坦酯组收缩压较 SH 模型组下降，差异有统计学意义(P 0.01)，表明天丹降压方对SH 肝阳上亢模型有明显的降压作用;天丹降压方各剂量组、坎地沙坦酯组血浆中 TL4、NF B、TNF、IL6 含量较 SH 模型组下降，差异均有统计学意义(P0.01)，表明天丹降压方可防治高血压血管炎性内皮损伤。因此我们推测天丹降压方降压机制可能与其通过 TL4/NFB 通路抑制炎症因子表达及降低血管内皮损伤的作用有关。综上，本研究从现代医学的角度肯定了天丹降压方对高血压病的治疗效果，为天丹降压方治疗高血压病提供了坚实的理论基础。但天丹降压方是复方中药，组成复杂，其中对高血压病起作用的具体药物或药对还有待进一步探索。由于天麻、丹参为该方君药，我们推测是其配伍对高血压病起到作用，故该实验为我们进一步研究天麻、丹参配伍对高血压病的疗效和具体作用机制奠定了实验基础。参考文献 1 中国高血压防治指南 修订委员会.中国高血压防治指南2018 年修订版J心脑血管病防治，2019，19(1):144 2喻正科，陈志红，解发良，等天丹降压颗粒逆转高血压左心室肥厚及改善舒张功能的临床研究J 湖南中医药大学学报，2009，29(1):5052 3胡旦，朱筱婧，王国庆，等天丹降压方联合硝苯地平缓释片治疗原发性高血压病 30 例临床观察J湖南中医杂志，2021，37(10):57 4王国庆，胡旦，卿媛媛，等天丹降压方治疗高血压病伴高尿酸血症肝阳上亢证 30 例 J 湖南中医杂志，2021，37(12):810 5周仲瑛.中医内科学M 北京:中国中医药出版社，2010:297303 6PIOLI M，DE FAIA AP.Proinflammatory cytokines and resist-ant hypertension:Potential for novel treatments?J Curr Hyper-tens ep，2019，21(12):95 7SUN D，YANG W，WANG Z，et alEfficacy of beraprost sodium com-bined with sildenafil and its effects on vascular endothelial functionandinflammationinpatientsexperiencingleftheartfailurecomplicated with pulmonary arterial hypertension J Med Sci Monit，2021，27:e928413 8翟昌明，鲁放，马重阳，等试述肝火证、炎症反应、高血压三者之关系J 环球中医药，2019，12(12):18581861 9WANG YM，JI，Chen WW，et alPaclitaxel alleviated sepsisin-duced acute lung injury by activating MUC1 and suppressingTL4/NFB pathwayJ Drug Des Devel Ther，2019，13:33913404(收稿日期:20220428)761第 1 期陶源，胡旦，王国庆，等:天丹降压方对自发性高血压肝阳上亢模型大鼠的影响