番茄组织培养.docx

番茄组织培养protocol1 播种 数取一定数量的番茄种子，用75%的乙醇浸泡消毒5分钟，5分钟后倒掉乙醇溶液，再将种子用4%的次氯酸钠浸泡消毒10分钟，消毒后用无菌水洗涤7-8次，每次需充分洗涤，彻底去掉残留的消毒剂。种子洗涤干净后，将种子播在种子萌发培养基T0，以每瓶30-40颗种子为宜。2 种子萌发T0：将播好的种子，首先在暗室培养3-4天，待种子冒出白色小芽后放置光下培养3-4天，一般种子萌发7-8天便可进行取材用于组织培养。3 预培养阶段T1 将生长7-8天的番茄小苗置于无菌水中，一般取小苗的子叶和茎部两个鲜嫩部位作为组织培养材料，用剪刀剪去子叶的叶尖，将剩余部分剪成5*5mm的方块，茎端出去根部和生长点区，将剩余的部分剪成6-8mm长。将处理好的外植体置于预培养培养基上，培养基上提前铺好滤纸，子叶背面朝上放置，摆放间隔以5-10mm为宜。4 共培养阶段T1将预培养2天后的外植体浸泡于侵染液中，浸泡期间需不断震荡，侵染5分钟后倒掉浸染液，将多余的浸染液用滤纸吸干后，将外植体重新置于预培养培养基，在暗室共培养2天。 浸染液的配置：挑取含有重组质粒的农杆菌EHA105单菌落于3ml含有50mg/L利福平和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，28度培养箱摇过夜。次日取摇好的农杆菌菌液200uL于含有含有50mg/L利福平和卡那霉素50mg/L的20mL LB液体培养基中，28度培养箱摇6-7小时，以OD=0.5-0.6最佳。将菌液在5000r/min离心10分钟，沉淀用无菌水稀释至OD=0.1-0.2作为侵染液，配置好的侵染液需立即用于侵染实验。5 芽诱导期T21将共培养2天后的外植体从暗室取出，全部置于芽诱导培养基T21，在光下培养7天后转入新的T21培养基中进行继代培养。第一次继代培养后，一般每隔2周进行下一次继代培养，直至外植体发芽完全。6 芽伸长期T22经过芽诱导期后，待外植体发芽芽长约为2-3cm时转入芽伸长培养基T22中，培养3-4周。7 生根期Tr当芽伸长至4-5cm时，剪掉愈伤组织后将芽转入到生根培养Tr中，培养3-4周。8 土培期将生根旺盛，生长到一定高度的小苗即时转入土盆里。表 各阶段培养基成分表，其中配置体积以1L为例，抗生素以潮霉素为例 成分种类MS盐蔗糖琼脂抗生素潮霉素抗菌素特美汀激素T02.22g15g7g_ _T14.43g30g7g_6-BA 1mg/LIAA 0.1mg/LT214.43g30g7g10mg/L200mg/LZT 1mg/LIAA 0.1mg/LT224.43g30g7g10mg/L200mg/LZT 0.5mg/LGA 1mg/LTr2.22g30g7g5mg/L150 mg/LIBA 2mg/L注：以上操作全部在超净工作台进行。