基因工程基本过程doc.doc
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1、基因工程基本过程【实用文档】doc文档可直接使用可编辑,欢迎下载基因工程基本过程基因工程(genetic ngieering),也叫基因操作、遗传工程,或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中,并使之无性繁殖(称之为克隆”)和行使正常功能(称之为表达”),从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来,基因工程是专指用生物化学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的NA片段)与载体系统(病毒、细菌质粒或噬菌体)的DNA结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制,继而通过转
2、化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子,无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子,或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系,使重组基因在细胞内表达,产生特定的基因产物.常用的工具酶限制性内切酶主要用于D分子的特异切割 NA甲基化酶-用于DN分子的甲基化 核酸连接酶-用于DN和RN的连接核酸聚合酶用于DA和RN的合成核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割核酸末端修饰酶-用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。主要过程有为四步:一 获得目的基因有多种方法可获得目得基因1. 构建cD文库分离目的基因过程:(1) 从真核细胞中提取mRN,以其为模板,在反转
3、录酶的作用下合成cN的第一条链。(2) 以第一条链为模板,以反转录酶或DA聚合酶作用下合成cDNA的第二条链。(3) 在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。(4) 接头或衔接子连接。(5) 凝胶过滤分离cDNA。(6) 通过核酸探针法或免疫反应法从cNA文库中分离特异cDN克隆。2.人工化学合成法适于已知的核苷酸序列且校小的DN片断合成,常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。过程:先用以上方法合成基因A不同部位的两条链的寡核苷短片段,再退火成为两端形成粘性末端的DN双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的DA片段,再用连接酶连接成完整
4、的基因.3.利用PCR技术直接扩增目的基因PC(Polmerse ai Reatin)法,又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,已知待扩增目的基因或DN片段两侧的序列,根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物,类似于DNA的天然复制过程,用PR法进行扩增,特异地合成目的cDNA链,用于重组、克隆。二载体的选择与制备1载体的选择(以质粒为例)载体必须是复制子。具有合适的筛选标记,便于重组子的筛选。具备多克隆位点(MCS),便于外源基因插入。自身分子量较小,拷贝数高。在宿主细胞内稳定性高。(6) 应具有很强的启动子,能为大肠杆菌的RN聚合酶所识别(7) 应具有阻遏子,使启动子受到控制,只有当诱导时才能
5、进行转录。(8) 应具有很强的终止子,以便使RN聚合酶集中力量转录克隆的外源基因,而不转录其他无关的基因,且所产生的mRN较为稳定。(9) 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。2. 制备有多种分离质粒的方法,如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等.目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体,裂解细胞,将质粒DNA与染色体D分开及除去蛋白质和RNA。在pH值12015范围内时,线性的NA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性,线性染色体形成网状结构,而cccDNA可以准确迅速复性,通过离心去除线性染色体,获得含有ccDNA的上
6、清液,最后用乙醇沉淀,获得质粒NA.三。构建基因表达载体1. 用一定的限制酶切割质粒,使其出现一个切口,露出粘性末端。2. 用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端.3. 将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,再加入适量NA连接酶,形成了一个重组DA分子(重组质粒).四目的基因导入受体细胞1. 将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法2. 将目的基因导入动物细胞显微注射法3. 将目的基因导入微生物细胞(以大肠杆菌为例)(1)用C2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.(2)将重组表达载体DN分子溶于缓冲液中与感受
7、态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收D分子,完成转化过程.(3)目的基因在受体细胞内,随其繁殖而复制,由于细菌繁殖的速度非常快,在很短的时间内就能获得大量的目的基因.五.目的基因的检测与鉴定1.要检测目的基因是否插入转基因生物染色体的DA上检测方法:采用NA分子杂交技术2检测目的基因是否转录了mR检测方法:同样用分子杂交技术DNA与RNA杂交3.检测目的基因是否翻译成蛋白质检测方法:提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原抗体杂交,若有杂交带,表明目的基因已形成蛋白质产品. 基因工程制药实例及意义抗生素类 传统的抗生素生产,主要利用化学合成或微生物发酵来获得,其生产过程中菌种的表达水平比较低,
8、生产成本比较高,而且在使用过程中容易产生耐药菌群.而利用基因工程技术可以对生产菌种进行基因改造,得到表达水平高、产品目的性强的菌株,如大肠杆菌生产青霉素酞胺酶。德国一个科研小组对生产半合成青霉素的材料AA用基因工程来增强大肠杆菌的青霉素酰胺酶活性。将大肠杆菌的基因PR32的质粒克隆化所形成的菌株,其酶活力比原株提高倍.从而提高6PA生产能力.我国王以光利用基因重组技术对螺旋霉素产生菌进行改造,增强了丙酰基转移酶的基因在螺旋霉素产生菌中的表达,并提高了丙酰螺旋霉素的产量.。2 基因工程的基本操作程序【课标要求】1.简述基因工程基本操作程序的四个步骤2尝试设计某一转基因生物的研制过程。【本节重难点
9、】重点:基因工程基本操作程序的四个步骤难点:(1)从基因文库中获取目的基因 (2)利用PC技术扩增目的基因【学习过程】一、基因工程的基本操作程序简述目的基因的;的构建;将目的基因;目的基因的。二、基因工程的基本操作程序(一)目的基因的获取1目的基因:主要是指的基因,也可以是一些具有作用的因子。2.原核细胞和真核细胞的基因结构()原核细胞的基因结构(2)真核细胞的基因结构3目的基因的获取目的基因可以从中分离出来,也可以用合成。常用的方法有以下几种:(1)从基因文库中获取目的基因基因组文库和部分基因文库(如D文库) 基因组文库 cDNA文库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内
10、含子基因多少物种间的基因交流从基因文库中得到目的基因,可以根据一些信息,如根据基因的、基因的、基因在染色体上的、基因的,以及基因的等特性。(2)利用PCR技术扩增目的基因PCR是_技术,是的缩写。原理:_。,前提:有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成_.条件:DN模板、。扩增过程:a变性():目的基因DA受热变性后接连为单链b.退火():与单链相应互补序列结合c延伸():在的作用下进行延伸Ta酶的特点是。PCR技术与DNA复制的比较:PC技术N复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果(3)化学法直接合成适用于基因比较,核苷酸序列又。(二)基因工程的核心。基因表达载体的构建
11、,其目的是使目的基因在受体细胞中能,并且可以,同时,使目的基因能够.基因表达载体+(1)启动子:是一段有特殊结构的,位于基因的,它是识别和结合的部位,有了它才能驱动基因,最终获得所需要的蛋白质。(2)终止子:也是一段有特殊结构的,位于基因的,相当于一盏红色信号灯,使在所需要的地方停止下来。(3)标记基因:作用是为了,从而将含有目的基因的细胞出来,如基因。构建基因表达载体的过程:用(同、不同)种限制酶去切目的基因与运载体,再用使其连接,形成重组DNA分子。(三)将目的基因导入受体细胞将目的基因受体细胞,并且在受体细胞内和的过程,称为转化.(1)将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法法法()将目的基因
12、导入动物细胞技术是将目的基因导入受体细胞的最有效方法.操作程序:将含有目的基因的表达载体获得显微注射胚胎胚胎发育成具有新性状的动物(3)将目的基因导入微生物细胞原核生物作为基因工程受体细胞的优点:。大肠杆菌细胞最常用的方法:a.用处理细胞,使细胞处于一种的生理状态,这种细胞称为细胞;b将分子溶于缓冲液与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收N分子.(四)目的基因的检测与鉴定(1)检测转基因生物的上是否插入了目的基因检测方法:技术,即将转基因生物的基因组DN提取出来,在含有目的基因的DN片段上用放射性同位素等作标记,以此作为,使探针与基因组N杂交,如果出现,就表明目的基因已插入染色体D
13、NA中。(2)检测目的基因是否检测方法:技术(3)检测目的基因是否检测方法:,从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行检测,若有出现,表明目的基因已形成蛋白质产品。()进行水平的鉴定【巩固练习】1.下列正确表示基因操作“四部曲”的是 ( ).提取目的基因目的基因导入受体细胞基因表达载体的构建目的基因的检测和鉴定B目的基因的检测和鉴定提取目的基因基因表达载体的构建目的基因导入受体细胞C提取目的基因基因表达载体的构建目的基因导入受体细胞目的基因的检测和鉴定D基因表达载体的构建提取目的基因目的基因导入受体细胞目的基因的检测和鉴定。下列不属于获得目的基因的方法的是 ( )A。利用N连接酶复制目的基因
14、 B利用D聚合酶复制目的基因C从基因文库中获取目的基因 D。利用PCR技术扩增目的基因3。PCR技术扩增DN,需要的条件是( )目的基因 TP 四种脱氧核苷酸 NA聚合酶等 mRA核糖体A。 B 。 4.根据NA的信息推出获取目的基因的方法是( )用DNA探针测出目的基因 用mNA探针测出目的基因C。用mRA反转录形成目的基因 D用PCR技术扩增mRA。在已知某小片段基因碱基序列的情况下,获得该基因的最佳方法是( )A用mRN为模板逆转录合成.以4种脱氧核苷酸为原料人工合成。由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA .将供体DN片段转入受体细胞中,再进一步筛选。下列不属于目的基因与运载体结合过程的是(
15、 )A.用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端B用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端C将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处D.将重组DNA导入受体细胞中进行扩增7.下列哪项不是基因表达载体的组成成分( )A启动子 B。终止密码子 C标记基因 复制原点8。在基因表达载体的构建中,所需要的酶是( )限制酶 DN连接酶 解旋酶 DNA聚合酶A. B D.植物学家在培育抗虫棉时,对目的基因作适当修饰,使目的基因在棉花植株的整个生长发育期都表达,以防止害虫侵害,这种对目的基因所作的修饰发生在()A.终止子 .引物 C标记基因 .启动子10下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( )。基因枪法 B。显微注
16、射法 .农杆菌转化法 D花粉管通道法11在基因工程操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的是( )A人工合成目的基因 B.目的基因与载体结合C将目的基因导入受体细胞 。目的基因的检测与鉴定12将目的基因导入微生物细胞之前,要用C2+处理细胞,处理过的细胞叫( )A感受态细胞 B。敏感性细胞 C。吸收性细胞 接受细胞13农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞,目的基因的最终位置是( )A质粒上 B受体细胞染色体上 C.裸露细胞核中 D。存在细胞质中14。目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( )检测受体细胞是否有目的基因
17、 检测受体细胞是否有致病基因检测目的基因是否转录mRA 检测目的基因是否翻译蛋白质 AB C 15.要检测目的基因是否成功地插入了受体DNA中,需要用基因探针,基因探针是指( )A。用于检测疾病的医疗器械B用放射性同位素或荧光分子等标记的NA分子C合成球蛋白的DAD合成苯丙羟化酶的DNA片段16(多选)用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述正确的是( )A常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒BA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必须的工具酶C。可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达17(多选)我国科学家运用基因工程技术
18、将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达,培育出了抗虫棉。下列叙述正确的是( )A.基因非编码区对于抗虫基因在棉花细胞中的表达不可缺少B.重组DA分子中增加一个碱基对,可能导致毒蛋白的毒性丧失抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物,从而造成基因污染D转基因棉花是否具有抗虫特性是可以通过检测棉花对抗生素抗性来确定的18(多选)科学家通过基因工程的方法,能使马铃薯块茎内含有人奶主要蛋白。以下有关该基因工程的叙述,正确的是 ( ) A。采用反转录的方法得到目的基因有内含子B基因非编码区对于目的基因在块茎中表达是不可缺少的C。马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞D用同一种限制性内切酶,分别处理质粒
19、和含目的基因的DNA,可产生黏性末端而形成重组DNA分子19.资料显示,近十年来,R技术(DNA聚合酶链式反应技术)成为分子生物实验的一种常规手段,其原理是利用DNA半保留复制的特性,在试管中进行D的人工复制(如下图),在很短的时间内,将NA扩增几百万倍甚至几十亿倍,使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答:(1)加热至9的目的是使DNA样品中的_键断裂,该过程在生物体细胞内是通过_酶的作用完成的。分析可知新合成DNA分子中A=T,C=G,这说明分子的合成遵循_.(2)与细胞内DN复制相比,PCR技术所需要的NA聚合酶的最适温度比较_(高、低)。(3)通过C技术使DNA分子
20、大量复制时,若将一个用1N标记的模板DA分子(第一代)放入试管中,以14标记的脱氧核苷酸为原料,连续复制到第五代时,含1N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为。(4)PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利,而且改进了检测细菌和病毒的方法.若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒,你认为可以用PR扩增血液中的( )A。白细胞DA B.病毒蛋白质 C血浆抗体 D.病毒核酸20.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点,请回答下列问题:(1)一个图所示的质粒经ma切割前后,分别含有个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造,插入的Sa酶切位点越多,其热稳定性越.(3)用图中的质粒和外源D
21、NA构建重组质粒,不能使用Sa切割,原因是。(4)与只使用Eco I相比较,使用Bam 和ind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止。()为了获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。(7)为了从DNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因,将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体,然后在的培养基中培养,以完成目的基因表达的初步检测。12 基因工程的基本操作程序答案AAB BDB ABCB AD BC C19(1)氢 解旋 碱基互补配对原则 (2)高 ()11 (4) D20()0、2(2)高(3)Sma会破坏质粒的抗
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