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米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性维生素的测定

( 江南大学化学与材料工程学院, 江苏无锡214122)
摘要: 微波浸提法研究了米糠多糖的提取, HPLC法同时测定了米糠中4种水溶性维生素。
料液比为1: 8在50％微波火力条件下浸提30min, 三氯乙酸去蛋白, 两步去淀粉, 30％醇沉, 米糠多糖得率达1.41%。以体积比为88:12的0.1％磷酸水溶液-甲醇为流动相, 以0.6 mL/min流速等度洗脱, 在266nm波长下检测。各组分在8min能基线分离。米糠中VB1、 VB6、 烟酸和烟酰胺的含量分别为7.7×10-6 g/g、 1.3×10-6g/g、 14.9×10-6 g/g、 16.2×10-6 g/g。
关键词: 米糠; 多糖; 微波浸提; 水溶性维生素; 高效液相色谱
Study on Microwave Assistant Extraction of Rice Bran Polysaccharides and Determination of Water-Soluble Vitamins in Rice Bran
Abstract: Microwave assistant extraction has been applied for polysaccharides in rice bran samples. The best technology were that the material-water ratio was 1:8, the time of microwave assistant extraction was 30 min under 50% firepower. It was proved that α-amylase could wipe off amylum effectively by two steps, and trichloroacetic acid method was the best way to wipe off albuminoid. And the ethanol concentration was 30%, the extraction rate of the water-soluble polysaccharides of rice bran was 1.41%.High performance liquid chromatography (HPLC) has been applied for the simultaneous determination of four kinds of water-soluble vitamins including vitamin B1, vitamin B6, nicotinic acid, and nicotinamide in rice bran. The separation was performed on a Hypersil C18 column (250 cm×4.6mm i.d., 5.0 μm) with a mobile phase of 0.1% H3PO4- methanol (88:12, V/V) at flow rate of 0.6 mL /min, and detection wavelength was 266 nm.. Baseline separation of four vitamins can be achieved within 8 minutes.The content of 7.7×10-6 g/g、 1.3×10-6g/g、 14.9×10-6 g/g、 16.2×10-6 g/g for vitamin B1, nicotinic acid ,vitamin B6 and nicotinamide.
Key words: rice bran; polysaccharides; microwave assistant extraction; water-soluble vitamins; high performance liquid chromatography
米糠是一类具有广泛开发潜力的高附加值资源, 含有稻米的64％营养物质及90％人体所需要的各种营养元素[1], 包括维生素、 米糠多糖、 氨基酸、 脂肪酸、 矿物质, 还有二十八碳烷醇、 神经酰胺等生理功能卓越的活性物质[2]。米糠多糖( Rice Brain polysaccharide, RBP) 存在于稻谷的颖果皮层里, 主要是指分子量不等的一类非淀粉多糖。采用不同的提取工艺会得到不同的米糠多糖组分。米糠多糖具有广泛的生理活性, 在抗肿瘤, 增强免疫力, 降血糖, 降脂方面有显著效果; 水溶性维生素是一类重要的营养成分, 在各种保健品[3], 功能型饮料中得到应用。烟酸和烟酰胺能够促进头皮血液循环, 防止脱发; VB6具有美发功效; VB1具有滋养与深层清洁的作用, 因此化妆品中也常添加微量的维生素[4]。因此, 本实验对这两种活性成分进行了研究。
多糖提取的方法有微波浸提法, 热水蒸煮法, 超声波提取法等。实验中考察了米糠多糖的提取方法及去除杂质方法。选取较优的微波提取法, 并对其提取工艺参数进行了进一步优化。测定维生素的方法有紫外分光光度法[5]、 荧光法[6]和高效液相色谱法( HPLC) [7]。但HPLC技术用于米糠中水溶性维生素的测定还未见报道。实验采用HPLC建立了米糠中的水溶性维生素的测定方法, 对样品前处理方法进行了研究, 对测定体系各影响因素进行了优化。方法简便快速, 准确可靠, 对复杂体系中水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。
一 米糠多糖的提取研究
1. 米糠多糖的提取
1.1 实验材料
米糠: 无锡秦良商贸有限公司
耐高温α-淀粉酶: 无锡酶制剂厂, 0IU/g
试剂: 无水乙醇、 石油醚、 三氯乙酸、 盐酸均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2仪器
722型可见光分光光度计; LD4-2A型台式离心机; Panasonic微波炉; 真空冷冻干燥机。
1.3实验方法
1.3.1 米糠样品的前处理
将米糠用石油醚按1: 3比例脱脂1小时, 重复3次, 自然干燥。
1.3.2 用改进的硫酸-苯酚法测米糠多糖含量
1.3.2.1 显色剂的制备
将50 mL浓硫酸缓缓加入10 mL水中, 冷却至室温, 加入0.6 g苯酚晶体搅拌使其溶解配成显色液。
1.3.2.2 硫酸-苯酚法测米糠多糖含量
取1.00 mL稀释一定倍数的糖液于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀; 取1.00 mL蒸馏水于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀, 得到参比溶液。将标准溶液和参比溶液置于沸水浴中保温30~35 min, 取出后放在冷水浴中冷却至室温, 于490 nm波长处测定其吸光值。
传统的硫酸-苯酚测糖法的操作过程是: 取1.00 mL样品加1.00 mL水, 加1.00 mL 6 %苯酚摇匀后再加入5 mL浓硫酸, 振荡显色, 静置30 min后, 于490 nm处检测其吸光度。加入硫酸时系统显色温度相差较大, 而造成相应的偶然偏差。而改进后的方法, 由于先把水和硫酸混合, 对浓硫酸起到了稀释作用, 用冰水冷却最后加入苯酚晶体, 配成显色液。经过沸水浴加热来使其显色, 保证了反应系统温度一致, 很好地解决了检测重现性与准确度的问题。
1.3.3去除杂质方法的比较
在多糖提取的过程中, 蛋白与淀粉的去除会影响到多糖的纯度与得率。因此本实验采用50%微波火力浸提30min, 重复两次提取。考察了Sevage法与三氯乙酸法去蛋白法; 同时也考察了淀粉一步消化法与两步消化法。正交实验见表1。实验结果见图 1。

Sevage法
三氯乙酸法
一步消化法
两步消化法
30%醇沉
Ⅰ
√

√

√
Ⅱ
√

√
√
Ⅲ

√
√

√
Ⅳ

√

√
√

由此能够看出: 淀粉一步消化所得多糖略高于两步消化所得, 可能是由于在较短的时间内淀粉未去尽, 而淀粉本身就是一种多糖物质, 为了得到较纯的米糠多糖, 实验优先考虑采用两步消化法; 在去蛋白的方法中, 比较Ⅱ、 Ⅳ得知, 采用Sevage法与三氯乙酸法所得米糠多糖含量差别不大, 考虑到Sevage法毒性较大, 耗时较长, 实验优先考虑三氯乙酸法。

图 1 正交实验结果
1.3.4 米糠多糖提取方法选择
1.3.4.1 微波浸提法
脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 10混合置于50％微波火力下浸提30min, 冷却, 离心得上层液, 重复提取两次, 合并上层液。在上层液中加入0.5％的耐高温α-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后, 再加入0.25％的0.5％的耐高温α-淀粉酶, 在相同的条件下保温消化15小时, 离心得上清液。用30％的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH＝4.5( 即米糠蛋白等电点, pI) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。在上述得到的上清液中, 加入无水乙醇, 使其含量为30％( V/V) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 离心, 得到米糠粗多糖RBPa溶液。用722型分光光度计测其吸光值, 计算米糠多糖含量。
1.3.4.2热水蒸煮浸提法
脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 10混合置于110oC水浴锅中, 使其保持沸腾状态2小时, 期间不断搅拌, 定时补入损失的水分, 冷却, 离心得上层液, 重复提取两次, 合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。
1.3.4.3 超声波浸提法
脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 10混合, 在80oC条件下超声提取30min, 冷却, 离心得上层液, 重复提取两次, 合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。
1.3.5比较结果
上述方法均是参考了有关文献报道, 采用的提取率相对较高的实验条件。经过722型分光光计对两种糖含量的测定, 见图2。可见, 微波法不但在提取时间而且在糖的浸出率方面更具有优势。因此实验采用微波浸提法, 并对提取时间, 提取火力进行了研究。

图 2 3种提取方法所得米糠多糖含量
1.3.5 微波浸提工艺
1.3.5.1 微波提取
脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 8混合, 分别在50％微波火力条件下浸提30min( Ⅰ) , 50min( Ⅱ) ; 100％微波火力条件下浸提30min( Ⅲ) 、 50min( Ⅳ) 。冷却, 离心。各重复两次提取, 合并上层液。
1.3.5.2 两步消化法去除淀粉
在上层液中加入0.5％的耐高温α-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后, 再加入0.25％的0.5％的耐高温α-淀粉酶, 在相同的条件下保温消化15小时, 离心得上清液。
1.3.5.3 三氯乙酸去除蛋白质
用30％的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH值＝4.5( 即米糠蛋白等电点, pI) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。
1.3.5.4乙醇沉淀米糠多糖
在上述得到的上清液中, 加入无水乙醇, 使其含量为30％( V/V) , 置于4oC冰箱中静置过夜, 离心, 得到米糠粗多糖RBPa。
1.3.5.5 不同提取条件下米糠多糖含量比较

图 3 微波提取4种条件所得米糠多糖含量
由图 3得知, 微波提取条件Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅳ, 可见微波火力增大会对多糖造成一定的破坏; 提取时间过长也存在同样的情况。
当微波辐射时间一定时, 微波火力越高, 物系吸收微波能越多, 物系温度升的越快, 固液传质速度亦越快; 且温度越高, 对物料细胞破坏作用越大, 有利于物料有效成分浸出。但当微波火力增加到一定程度时, 微波有可能促使米糠多糖分解, 反而使米糠多糖提取率下降。
1.3.5.6 真空冷冻干燥
将微波方法Ⅰ所得的米糠多糖RBPa透析48小时后, 冷冻干燥得到RBPa的固体粉末。
2讨论
因此, 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1: 8混合, 三氯乙酸法去除蛋白, 两步法去除淀粉, 在50％微波火力条件下浸提30min( Ⅰ) 为最佳米糠多糖提取方法。米糠得率为1.41％。
RBPa为淡黄色絮状固体, 无味。苯酚－硫酸试剂反应均呈棕红色, 与碘反应不显蓝色; 易溶于水, 不溶于乙醇、 乙醚和丙酮, 无甜味, 无挥发性, 水溶液为浅黄色。
二、 高效液相色谱法测定米糠中的水溶性维生素
1 实验部分
1.1 仪器、 试剂与样品
仪器: Waters505高效液相色谱仪( 包括2487紫外检测器) , Empower色谱工作站。色谱柱: Hypersil C18( 250 cm×4.6mm i.d., 5.0μm) 。超声波振荡器( BRANSON SB 3200－T, 上海) ; 固相萃取柱( 固相PT-系列, 河北省津杨滤材厂) 等。
试剂: VB6( 纯度≥ 99％) 、 烟酰胺( 纯度≥ 99％) 、 烟酸( 纯度≥99.5％) 、 VB1( 纯度≥98％) 。均购自国药集团化学试剂有限公司( 上海) ; 甲醇为色谱纯, 水为超纯水, 其它试剂为分析纯。
米糠样品来源于无锡秦良商贸有限公司。
1.2 色谱条件
色谱柱: Hypersil C18 柱( 250 cm×4.6mm i.d., 5.0μm) , 流动相: A: 0.1 %磷酸水溶液, B:甲醇, 以体积比 A:B=88:12等度洗脱; 流速为0.6 mL/min。检测波长: 266nm; 进样量 20 μL。
1.3试液的制备
1.3.1标准溶液的制备
精确称取约0.05g的四种维生素标准品, 用0.01mol/L盐酸溶解并稀释到50 mL, 摇匀, 分别得到1.36×10-3 g/mL, 1.18×10-3 g/mL, 1.04×10-3g/mL和1.00 ×10-3.g/mL的 VB1, VB6, 烟酸和烟酰胺的标准储备液, 于4℃冰箱中保存。储备液用流动相稀释得所需浓度的标准溶液。
1.3.2 米糠供试品溶液的制备
取10.00g米糠于100mL锥形瓶中, 加入20mL混合溶剂( 体积比为80:20的甲醇－0.01mol/L盐酸溶液) 超声提取30min, 过滤, 滤渣用相同的条件重复提取两次, 合并提取液。用旋转蒸发仪蒸发浓缩, 浓缩液用无水乙醚萃取两次脱脂, 水相经0.45μm滤膜过滤, 再过固相萃取柱, 定容至10mL容量瓶中, 即得米糠供试品溶液。
2结果与讨论
在上述色谱条件下, 四种维生素在8min内达到基线分离, 得到4种维生素的标样图, 见图1
t/min

图1 水溶性维生素混合标准溶液色谱图
峰标: 1.VB1; 2.烟酰胺; 3.烟酸; 4.VB6
2.3方法学评价
2.3.1 重现性试验
取4种维生素的标准储备液等体积混和, 然后稀释16倍, 在上述优化实验条件下连续5次进样, 测得其峰面积及保留时间的相对标准偏差( RSD) 均小于2％, 结果表明其重现性较好。如表1所示
表1 重现性试验

组分
RSD( %) (n=5)
保留时间
峰面积
VB1
0.04
0.70
烟酸
0.05
0.50
VB6
0.12
2.0
烟酰胺
0.04
0.79
2.3.2标准曲线及检出限
配置了一系列不同浓度的 VB1、 VB6、 烟酸和烟酰胺的混合标准溶液, 在优化的实验条件下, 进行了测定, 得出各组分的线性回归方程、 线性范围, 并以3倍信噪比得到检测限, 结果如表2所示。结果显示线性范围宽, 检测限低。
表2 回归方程及检测限
组分
线性范围/( g/mL)
回归方程
R2
检测限/ (g/mL)
VB1
8.5×10-7–8.5×10-5
Y=5.84×107X+28.42
0.9999
4.3×10-7
烟酸
9.3×10-7–6.5×10-5
Y=4.91×107X+7.07
0.9999
3.2×10-7
VB6
1.0×10-6–7.4×10-5
Y=1.45×107X+65.27
0.9999
3.4×10-7
烟酰胺
6.0×10-7–6.2×10-5
Y=6.06×107X–5.91
0.9999
3.0×10-7
2.4 样品的测定及回收率实验
按1.3.2和1.3.3方法处理好样品, 在优化好的色谱条件下, 进行测定。米糠样品的色谱图见图2; 米糠中维生素测定结果见表3。
t/min

图2 米糠样品的色谱图
表3 米糠中维生素的测定结果 (n=3)
样品
组分
含量
RSD( ％)

米糠
VB1
7.7×10-6 g/g
1.6
烟酸
14.9×10-6 g/g
2.1
VB6
1.3×10-6 g/g
1.2
烟酰胺
16.2×10-6 g/g
0.7

取米糠供试液做加标回收试验。结果见表4。回收率在96.0％～99.9％, 结果可靠。
表4 4种水溶性维生素的回收率测定结果 ( n=3)
维生素
试液浓度(g/mL)
加标准试液(g/mL)
测定含量(g/ml)
平均回收率/(%)
RSD/(%)
VB1
7.6×10-6
8.5×10-6
15.76×10-6
96.0
0. 5
VB5
14.8×10-6
6.5×10-6
21.07×10-6
96.4
1.6
VB6
1.3×10-6
7.4×10-6
8.69×10-6
99.9
4.9
烟酰胺
16.4×10-6
6.3×10-6
22.8×10-6
98.0
3.0

三、 结论
由此可见, 采用50％微波火力提取30min, 米糠多糖得率可达1.41％; 采用体积比为80:20的甲醇－0.01mol/L盐酸溶液超声提取30min, 经过高效液相色谱法对4种水溶性维生素含量进行了测定, 表明米糠中含有丰富的VB1、 、 烟酸、 烟酰胺、 VB6。本文的测定结果为开发绿色米糠化妆品提供了一定的依据。
参考文献
[1]毛金水,贺绪军,李翔,等.米糠营养素提取的研究与生产应用[J].副产物综合利用, ,34(6):45～47
[2]刘元法,王兴国,倪伯文,等.米糠活性物质二十八醇功能性研究[J].中国油脂, ,26(5):63～65