细菌耐药性检测和溯源研究进展.pdf

细菌耐药性检测及溯源方法细菌耐药性检测及溯源方法3食源性致病菌耐药性及流行现状食源性致病菌耐药性及流行现状报告提纲细菌耐药机制及传播细菌耐药机制及传播食源性致病菌耐药性检测及溯源研究食源性致病菌耐药性检测及溯源研究前前 言言抗生素大量无节制滥用日趋严重，人类耐药细菌感染率呈上升趋势，食源性抗生素大量无节制滥用日趋严重，人类耐药细菌感染率呈上升趋势，食源性致病菌耐药性问题致病菌耐药性问题日益突出日益突出。耐药菌株从饲养动物制成食品，到被食用的整个过程，环节多，周期长，忽耐药菌株从饲养动物制成食品，到被食用的整个过程，环节多，周期长，忽略经该途径传播的耐药菌株或耐药因子，略经该途径传播的耐药菌株或耐药因子，检测方法不完善，造成食源性耐药菌株及耐药因子进一步流行，甚至造成食检测方法不完善，造成食源性耐药菌株及耐药因子进一步流行，甚至造成食物链终端的人类因携带耐药菌株或耐药因子而无法物链终端的人类因携带耐药菌株或耐药因子而无法治疗治疗细菌感染性疾病。细菌感染性疾病。检测标准：检测标准：动物及其制品中细菌耐药性的测定动物及其制品中细菌耐药性的测定-纸片扩散法纸片扩散法SN/T1944-2007参考美国临床实验室标准化协会（参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）耐药准则进行耐药性判断，）耐药准则进行耐药性判断，CLSI准则定期对耐药性判断标准进行调整更新准则定期对耐药性判断标准进行调整更新。这可能会造成菌株在不同时期被判断这可能会造成菌株在不同时期被判断为不同的耐药性为不同的耐药性。食源性细菌耐药性禽畜饲养中，抗生素广泛应用于预防各类细菌性疾病，不遵守休禽畜饲养中，抗生素广泛应用于预防各类细菌性疾病，不遵守休药期规定，将未到休药期的畜禽出售或制成产品，抗生素残留很药期规定，将未到休药期的畜禽出售或制成产品，抗生素残留很可能造成超标。可能造成超标。动物养殖和治疗中，盲目加大抗生素使用剂量，在畜禽体内存留动物养殖和治疗中，盲目加大抗生素使用剂量，在畜禽体内存留时间延长，增加休药期增加。时间延长，增加休药期增加。提高家畜生产性能，作为生长促进剂在饲料中随意或提高添加抗提高家畜生产性能，作为生长促进剂在饲料中随意或提高添加抗生素，造成抗生素残留。生素，造成抗生素残留。屠宰前使用抗生素来掩盖患病家禽临床症状以逃避宰前检验，造屠宰前使用抗生素来掩盖患病家禽临床症状以逃避宰前检验，造成动物体内残留大量抗生素。成动物体内残留大量抗生素。主要来源主要来源：食用性动物：食用性动物类食品，肉类主要来源；类食品，肉类主要来源；动物源性食品（奶类，蛋动物源性食品（奶类，蛋类，鱼类等与动物养殖相类，鱼类等与动物养殖相关的食品）关的食品）食物链各环节中所有涉及食物链各环节中所有涉及的生产、加工、销售人员的生产、加工、销售人员，餐厅服务人员，可引起，餐厅服务人员，可引起细菌传播，耐药因子伴随细菌传播，耐药因子伴随传递的重要来源。传递的重要来源。食源性细菌耐药性食源性细菌耐药性4 4 20062006年年7 7月食品法典月食品法典委员会委员会(CAC)(CAC)第第2929届届会议设立了政府间抗会议设立了政府间抗生素耐药性特设工作生素耐药性特设工作组组国际协调会国际协调会(VICH)(VICH)下设抗下设抗生素耐药性专家工作组生素耐药性专家工作组，针对耐药性问题提出建议针对耐药性问题提出建议、制定国际公认管理和技、制定国际公认管理和技术标准。术标准。20072007年年4 4月月1212日发布“关于淘汰兽日发布“关于淘汰兽药品种及兽药安全评价品种目录”药品种及兽药安全评价品种目录”，对氧氟沙星、盐酸洛美沙星、甲，对氧氟沙星、盐酸洛美沙星、甲磺酸培氟沙星进行安全评价磺酸培氟沙星进行安全评价；20102010年前组织完成风险评估和安年前组织完成风险评估和安全评价工作全评价工作，防止兽用药产生耐，防止兽用药产生耐药性对人类带来危害药性对人类带来危害20142014年，国家质检总局发年，国家质检总局发布预警通报。加强对进口布预警通报。加强对进口肉类中肉类中耐甲氧西林金黄色耐甲氧西林金黄色葡萄球菌葡萄球菌检测检测抗生素耐药性监管抗生素耐药性监管19991999年年5 5月月，国际兽医局，国际兽医局成立抗生素耐药性特设工作组成立抗生素耐药性特设工作组我国农业部于我国农业部于20052005年年1010月月2828日发布日发布“兽药地方“兽药地方标准废止目录”中禁止人标准废止目录”中禁止人用抗生素用于食源性动物用抗生素用于食源性动物对某种敏感药物敏感细菌变成对该药物耐受，分为固有耐对某种敏感药物敏感细菌变成对该药物耐受，分为固有耐药性和获得性耐药性。药性和获得性耐药性。固有耐药性：细菌对某种抗菌药物表现出先天性不敏感，固有耐药性：细菌对某种抗菌药物表现出先天性不敏感，由细菌自身生物学特性（如结构、代谢机制）所决定。由细菌自身生物学特性（如结构、代谢机制）所决定。获得性耐药：细菌在后天生活过程中通过基因组的改变获获得性耐药：细菌在后天生活过程中通过基因组的改变获得了对原本敏感抗菌药物的耐药性，获得性耐药的途径包得了对原本敏感抗菌药物的耐药性，获得性耐药的途径包括自身突变和基因交换括自身突变和基因交换细菌耐药性定义细菌耐药性定义细胞壁增厚或细胞膜通透性改变细胞壁增厚或细胞膜通透性改变膜孔蛋白是抗生素进入菌体的通道之一膜孔蛋白是抗生素进入菌体的通道之一,耐药机制：通过改变跨膜通道孔蛋白的结构降低与药物耐药机制：通过改变跨膜通道孔蛋白的结构降低与药物结合力，减少或除去跨膜孔蛋白。结合力，减少或除去跨膜孔蛋白。产生灭活抗菌药物酶或钝化酶产生灭活抗菌药物酶或钝化酶最重要机制之一，此类酶通过修饰、水解乙酰化、磷酸化等破坏抗最重要机制之一，此类酶通过修饰、水解乙酰化、磷酸化等破坏抗生素或使之失去抗菌作用；可由质粒、染色体基因表达的酶主要包生素或使之失去抗菌作用；可由质粒、染色体基因表达的酶主要包括：括：-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶、红霉素内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶、红霉素酯化酶等。酯化酶等。生物被膜等其它因素生物被膜等其它因素3241细菌耐药产生机制及传播细菌耐药产生机制及传播药物主动外排系统药物主动外排系统非特异性，广泛存在；细胞膜上通过能量参与将抗生素排出非特异性，广泛存在；细胞膜上通过能量参与将抗生素排出细菌体外的一类蛋白质，也称外排泵，可单独或与细菌的其细菌体外的一类蛋白质，也称外排泵，可单独或与细菌的其他耐药机制如灭活酶、外膜屏障、靶位改变等协同，使细菌他耐药机制如灭活酶、外膜屏障、靶位改变等协同，使细菌产生耐药性甚至是多重耐药性。产生耐药性甚至是多重耐药性。细菌具有多种携带耐药基因的可转移细菌具有多种携带耐药基因的可转移遗传因子遗传因子自然条件下耐药基因可以多种途径在细菌间进行自然条件下耐药基因可以多种途径在细菌间进行水平转移水平转移添加标题细菌耐药性传播细菌耐药性传播耐药菌生物学耐药菌生物学流行病学特征流行病学特征1234细菌耐药性检测方法细菌耐药性检测方法细菌耐药表型检测细菌耐药表型检测细菌药敏试验细菌药敏试验（AST）：纸片扩散法、肉纸片扩散法、肉汤汤/琼脂稀释法琼脂稀释法、自动化仪器检、自动化仪器检测法、测法、E E-testtest法法等。等。纸片扩散法纸片扩散法应用广泛，应用广泛，WHOWHO推荐推荐K K-B B法法原理：将含有定量抗菌药物的纸原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分，溶解后不断向纸片周围中水分，溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长抑制，从而形成无菌生长的生长抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌程度，并与该药对测试菌MICMIC呈呈负相关。负相关。稀释法耐药试验：稀释法耐药试验：琼脂稀释法和肉汤稀释琼脂稀释法和肉汤稀释法法原理：将配置好的不同原理：将配置好的不同浓度抗菌药物与琼脂或浓度抗菌药物与琼脂或肉汤混和，使琼脂或肉肉汤混和，使琼脂或肉汤中的药物浓度呈依次汤中的药物浓度呈依次递增或递减的测试系列递增或递减的测试系列，接种定量细菌后过夜，接种定量细菌后过夜培养，肉眼观察能一直培养，肉眼观察能一直细菌生长的最低药物浓细菌生长的最低药物浓度为该药物的最低抑菌度为该药物的最低抑菌浓度（浓度（MICMIC）。）。E E-testtest试验试验：结合稀结合稀释法和扩散法，对药释法和扩散法，对药物的体外抗菌活性直物的体外抗菌活性直接定量的技术。接定量的技术。自动细菌鉴定和药敏自动细菌鉴定和药敏分析系统分析系统576核酸分子杂交核酸分子杂交：细菌抽细菌抽提质粒电泳、转膜并用特提质粒电泳、转膜并用特异性耐药基因探针杂交，异性耐药基因探针杂交，根据杂交信号，判断该质根据杂交信号，判断该质粒上是否存在该耐药基因。粒上是否存在该耐药基因。全基因组测序全基因组测序脉冲场凝胶电泳：脉冲场凝胶电泳：（康倩等利用（康倩等利用PFGE PFGE 分子分子分型方法对甘肃省细菌性分型方法对甘肃省细菌性痢疾监测点分离到的志贺痢疾监测点分离到的志贺菌进行耐药谱分析研究。菌进行耐药谱分析研究。）PCRPCR技术、实时荧光技术、实时荧光PCRPCR单链构象多态性：单链构象多态性：（PCRPCR-SSCPSSCP可直接检测临可直接检测临床痰样本中结核分枝杆菌基床痰样本中结核分枝杆菌基因突变）因突变）限制性片段长度多态性分限制性片段长度多态性分析：（析：（探针法检测幽门螺旋探针法检测幽门螺旋菌菌23S rRNA23S rRNA上耐大环内酯类上耐大环内酯类的耐药基因的点突变）的耐药基因的点突变）细菌耐药性检测方法细菌耐药性检测方法细菌耐药基因型检测细菌耐药基因型检测头孢西丁头孢西丁苯唑西林苯唑西林2007头孢西丁纸片扩散法可检测头孢西丁纸片扩散法可检测mecA阴性阴性葡萄球菌对苯唑西林耐药或敏感葡萄球菌对苯唑西林耐药或敏感纸片扩散法纸片扩散法22mm S21mm R2008MIC4g/ml S8g/ml R2010取代检测苯唑西林耐药取代检测苯唑西林耐药苯唑西林或耐药必须以头孢西丁为准苯唑西林或耐药必须以头孢西丁为准2012中介应测中介应测mecA或或PBP2a，头孢西丁，头孢西丁MIC或纸或纸片扩散法，苯唑西林片扩散法，苯唑西林MIC或苯唑西林盐筛选或苯唑西林盐筛选2013删除了金黄色葡萄球菌苯唑西林纸片删除了金黄色葡萄球菌苯唑西林纸片扩散法解释标准。扩散法解释标准。苯唑西林纸片扩散试验不可靠，当使用头孢苯唑西林纸片扩散试验不可靠，当使用头孢西丁作为替代试验报告苯唑西林纸片扩散试西丁作为替代试验报告苯唑西林纸片扩散试验结果时见头孢西丁。验结果时见头孢西丁。20072007-20132013年年CLSICLSI关于关于MRSAMRSA检测标准的更新内容检测标准的更新内容新旧标准比对，药敏试验方法、选择试验药物等因素的更新存在相对滞后性，可能对食源性、动物源性细菌的耐药性检测产生影响。对于抗生素中介耐药的菌株无法直接判断该菌株是否具有耐药性，对于耐药基因尚未表达的菌株，影响菌株耐药性的准确判断。食品微生物学检验：金黄色葡萄球菌检验食品微生物学检验：金黄色葡萄球菌检验GB 4789.10食品微生物学检验：大肠埃希氏菌计数食品微生物学检验：大肠埃希氏菌计数GB 4789.38动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法SN/T1944SN/T1944-20072007CLSI标准标准及及M100-S23纸片扩散法检测纸片扩散法检测ESBL，用头孢他啶（，用头孢他啶（CAZ,30g/片）和头孢他啶片）和头孢他啶+克拉维酸（克拉维酸（CCA/CA,30g/10g）组合、头孢噻肟（）组合、头孢噻肟（CTX,30g/片片)和头孢噻肟和头孢噻肟+克拉维酸克拉维酸（CTX/CA,30g/10g）组合，分别测量两种纸片加）组合，分别测量两种纸片加CA后的抑菌环直径。对后的抑菌环直径。对2个中任何一个药物加个中任何一个药物加CA后抑菌环的直径差后抑菌环的直径差5时，可确认为产时，可确认为产ESBLs菌株。菌株。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌大肠杆菌食源性样品金黄色葡萄球菌耐药菌株及敏感菌株大肠杆菌耐药菌株及敏感菌株MRSAESBLs食源性致病食源性致病菌菌耐药性耐药性表型检测表型检测图图2-1 MSSA(A,C)和和MRSA(B,D)纸片扩散法纸片扩散法药敏试验结果药敏试验结果图图2-2 产产ESBL大肠杆菌大肠杆菌(A,C)和非产和非产ESBL(B,D)大肠杆菌药敏试验结果大肠杆菌药敏试验结果食源性致病食源性致病菌菌耐药性耐药性分子生物学检测分子生物学检测1.金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌耐药性检测耐药性检测1.11.1 金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、MRSAMRSA及氨基糖苷类耐药基因四重及氨基糖苷类耐药基因四重PCRPCR检测检测12345Marker 1 2 3 4 53.MRSA/MSSA3.MRSA/MSSA及氨基糖苷类耐及氨基糖苷类耐药基因四重药基因四重PCRPCR-电泳电泳2.MRSA/MSSA2.MRSA/MSSA及氨基糖苷类耐药及氨基糖苷类耐药基因四重基因四重PCRPCR-DHPLCDHPLC1.MRSA/MSSA及氨基糖苷及氨基糖苷类耐药基因四重类耐药基因四重PCR-电泳电泳1.2 金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、MRSA及红霉素耐药基因四重及红霉素耐药基因四重PCR检测检测Marker1 2 31231.金葡菌金葡菌MRSA/MSSA及红霉及红霉素耐药基因四重素耐药基因四重PCR-电泳电泳2.金葡菌金葡菌MRSA/MSSA及红霉素耐及红霉素耐药基因四重药基因四重PCR-DHPLC1.3 金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、MRSA及四环素耐药基因三重及四环素耐药基因三重PCR检测检测1 2122.金葡菌金葡菌MRSA/MSSA及四环及四环素耐药基因三重素耐药基因三重PCR-DHPLC1.金葡菌金葡菌MRSA/MSSA及四环及四环素耐药基因三重素耐药基因三重PCR-电泳电泳1.41.4金黄色葡萄球菌特异基因和耐药基因七重金黄色葡萄球菌特异基因和耐药基因七重PCRPCR-DHPLCDHPLC检测检测灵敏度试验灵敏度试验1.51.5 金黄色葡萄球菌鉴定及常见耐药基因实时荧光金黄色葡萄球菌鉴定及常见耐药基因实时荧光PCRPCR方法方法食源性食源性MRSA双色实时荧光双色实时荧光PCR检测检测图图 FAM通道金黄色葡萄球通道金黄色葡萄球ATCC33591、ATCC29213nuc基因检测重复基因检测重复10次结果次结果图图 HEX通道金黄色葡萄球通道金黄色葡萄球ATCC33591、ATCC29213mecA基因检测重复基因检测重复10次结果次结果2、大肠杆菌大肠杆菌耐药基因检测耐药基因检测2.1 大肠杆菌鉴定及大肠杆菌鉴定及类整合子基因二重类整合子基因二重PCR检测检测123Marker 1 2 3大肠杆菌鉴定及大肠杆菌鉴定及类整合子基因二重类整合子基因二重PCR-DHPLC检测检测（大肠杆菌鉴定基因大肠杆菌鉴定基因E.coli16S23SrRNA和和类整合子类整合子基因基因int）大肠杆菌鉴定及大肠杆菌鉴定及类整合子基因二重类整合子基因二重PCR-电泳电泳检测检测（大肠杆菌鉴定基因大肠杆菌鉴定基因E.coli16S23SrRNA和和类整合类整合子子基因基因int）2.2 大肠杆菌四环素耐药基因二重大肠杆菌四环素耐药基因二重PCR检测检测1 2 3123大肠杆菌四环素耐药基因二重大肠杆菌四环素耐药基因二重PCRPCR-电泳电泳检测检测大肠杆菌四环素耐药基因二重大肠杆菌四环素耐药基因二重PCRPCR-电泳电泳检测检测2.3 大肠杆菌常见耐药基因四重大肠杆菌常见耐药基因四重PCR检测检测1.1.大肠杆菌常见耐药基因四重大肠杆菌常见耐药基因四重PCRPCR-电泳电泳2.2.大肠杆菌常见耐药基因四重大肠杆菌常见耐药基因四重PCRPCR-DHPLCDHPLC检测检测3 3、肠球菌耐药基因多重、肠球菌耐药基因多重PCRPCR-DHPLCDHPLC检测检测4 4、沙门氏菌耐药基因多重、沙门氏菌耐药基因多重PCRPCR-DHPLCDHPLC检测检测5 5、食源性致病菌、食源性致病菌PCRPCR-DHPLCDHPLC分型溯源分型溯源-5.15.1沙门氏菌分型溯源沙门氏菌分型溯源沙门氏菌沙门氏菌invA基因野生型菌株基因野生型菌株与突变菌株与突变菌株5.2 5.2 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌PCRPCR-DHPLCDHPLC分型溯源分型溯源1234金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌tetM不同型别不同型别DHPLC检测图谱检测图谱5.3 5.3 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及SCCmecSCCmec基因分型基因分型MRSA的的SCCmec多重多重PCR基因分型结果基因分型结果6.6.耐药性耐药性MALDIMALDI-TOF MSTOF MS检测检测及溯源及溯源利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI(MALDI-TOF MS)TOF MS)，针对蛋白指纹图谱分析鉴别，针对蛋白指纹图谱分析鉴别食源食源性致病菌性致病菌耐药株耐药株/敏感株，探索敏感株，探索MALDIMALDI-TOF MSTOF MS方法鉴方法鉴别产耐药菌株别产耐药菌株/敏感菌株可行性，利用聚类分析法敏感菌株可行性，利用聚类分析法进进行溯源研究。行溯源研究。6.1 6.1 金黄色葡萄球菌耐药性金黄色葡萄球菌耐药性MALDIMALDI-TOF MSTOF MS检测检测小结：小结：101101株金黄色葡萄球菌经前处理后，株金黄色葡萄球菌经前处理后，MALDIMALDI-TOF MSTOF MS鉴定鉴定，最匹配鉴定结果均为金黄色葡萄球菌，且可信度分值均大于最匹配鉴定结果均为金黄色葡萄球菌，且可信度分值均大于1.91.9，分布于，分布于1.971.97-2.462.46之间，此之间，此101101株菌株之间存在明显差异。株菌株之间存在明显差异。耐药株及敏感株为区分方式自定义到质谱数据库中，其中有耐药株及敏感株为区分方式自定义到质谱数据库中，其中有4 4株野生株野生敏感分离株被鉴定为耐药株，其余敏感分离株被鉴定为耐药株，其余9797株金黄色葡萄球菌均可通过株金黄色葡萄球菌均可通过MALDIMALDI-TOF MSTOF MS区分耐药株与敏感株，区分耐药株与敏感株，MALDIMALDI-TOF MSTOF MS与纸片扩散法检与纸片扩散法检测测耐药性耐药性结果符合率达结果符合率达96.04%96.04%。敏感株与耐药株敏感株与耐药株MALDI-TOF MS检测检测12将已验证耐药性将已验证耐药性（MRSA/MSSA）的金黄色葡萄球菌通过质谱软件自定义到质谱数据库中的金黄色葡萄球菌通过质谱软件自定义到质谱数据库中，对对101株金黄色葡萄球菌利用新建立的数据库进行株金黄色葡萄球菌利用新建立的数据库进行MRSA/MSSA鉴定鉴定，其中其中76株金黄色葡萄球菌株金黄色葡萄球菌的鉴定结果的鉴定结果（MRSA/MSSA）与携带与携带mecA基因的情况完全符合基因的情况完全符合，其其MRSA/MSSA的鉴定结果准的鉴定结果准确确，17株不携带株不携带mecA基因的菌株被鉴定为基因的菌株被鉴定为MRSA，8株携带株携带mecA的菌株被鉴定为的菌株被鉴定为MSSA，MRSA/MSSA的鉴定准确率为的鉴定准确率为75.25%。6.2 6.2 金黄色葡萄球菌耐药性金黄色葡萄球菌耐药性MALDIMALDI-TOF MSTOF MS溯源分析溯源分析101株金黄色葡萄球菌株金黄色葡萄球菌MALDI-TOF MS指纹图指纹图谱的聚类分析谱的聚类分析6.3 6.3 大肠杆菌耐药性质谱检测大肠杆菌耐药性质谱检测6.4 6.4 大肠杆菌耐药性质谱溯源大肠杆菌耐药性质谱溯源结论分析结论分析1.1.MALDIMALDI-TOF MSTOF MS：鉴定食源性致病菌耐药菌株；：鉴定食源性致病菌耐药菌株；筛选金黄色葡萄筛选金黄色葡萄球菌球菌MRSA/MSSAMRSA/MSSA2.2.鉴定大肠杆菌鉴定大肠杆菌OXAOXA型型ESBLESBL耐药菌株耐药菌株。3.3.MALDIMALDI-TOF MSTOF MS聚类分析中，菌株差异程度表示菌株之间亲缘关聚类分析中，菌株差异程度表示菌株之间亲缘关系远近程度，系远近程度，建立建立已确认耐药表型和耐药基因的金黄色葡萄球已确认耐药表型和耐药基因的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌肽指纹图谱溯源数据库，利用该数据库信息对未菌和大肠杆菌肽指纹图谱溯源数据库，利用该数据库信息对未知菌株进行溯源研究，分析未知菌株耐药情况。知菌株进行溯源研究，分析未知菌株耐药情况。