Myostatin干扰质粒的构建及在C2C12细胞中的效果验证.docx
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1、Myostatin干扰质粒的构建及在C2C12细胞中的效果验证【摘要】 目的:研究Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。方法:根据Myostatin mRNA序列,选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链以及1个无干扰作用DNA链,退火后插入表达载体,构建3个RNAi阳性质粒:M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer及一个阴性质粒Mc/ pSilencer并转染C2C12细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot观察RNAi对C2C12细胞中Myostatin mRNA和蛋白表达
2、的下调作用。结果:构建的3个阳性干扰质粒中M1/pSilencer能显着降低C2C12细胞中Myostatin表达量,随着M1/pSilencer干扰质粒剂量的增加,Myostatin表达量逐渐降低。结论:成功构建Myostatin RNAi质粒,该质粒能下调目的基因Myostatin在C2C12细胞中的表达量。【关键词】 Myostatin;RNA干扰;C2C12 Abstract Objective:To evaluate the role of RNA interference (RNAi) in silencing Myostatin expression in mouse C2C12
3、 cells (myoblast). Methods:Three target sequences and a negative sequence were selected according to Myostatin mRNA sequence,the complementary DNA contained both sense and antisense oligonueleotides were designed and synthesizedAfter annealing, the double strands DNA were ligated to thesiRNA express
4、ion vectorThree positive RNAi plasmids named M1/pSilencer, M2/pSilencer, M3/pSilencer, and the nagetive plasmid named Mc/pSilencer were transfected into the C2C12 cells, in which the silencing effect on Myostatin expression was investigated by real-time PCR and Western blot. Results:Among the three
5、RNAi positive plasmids, the M1/pSilencer could reduce Myostatin expression significantly. With the dose of plasmid M1/pSilencer increasing, the expression of Myostatin and mRNA decreased. Conclusion:The results indicated that Myostatin RNAi plasmids were obtained, and the RNAi plasmids could reduce
6、Myostatin expression in C2C12 cells. Key words Myostatin;RNAi;C2C12 1997年美国Johns Hopkins大学的研究人员从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆出Myostatin。蛋白质同源性比较证明Myostatin是TGF-超家族的新成员,又称生长分化因子8。在Myostatin敲除的小鼠体内,肌纤维发生广泛的增生和肥大,导致骨骼肌肌肉质量显着增加14。Myostatin编码序列发生突变的牛也出现肌肉质量显着增加,呈现“双肌现象”5,6。由此可见,Myostatin能抑制骨骼肌的生长,是骨骼肌生长的负性调控因子3,7。我们以前的
7、研究表明,在坐骨神经缺损后,失神经支配的腓肠肌Myostatin mRNA和蛋白具有特定的表达模式8,9,提示Myostatin在失神经性肌萎缩过程中扮演重要角色。为了进一步探讨Myostatin在失神经肌萎缩中的生物学作用,本实验构建小鼠Myostatin RNAi质粒,采用Western Blot及荧光定量PCR法,验证Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。 1 材料和方法 细胞及主要试剂 C2C12细胞株,购自北京军事医学科学院。DMEM,Lipofectamin 2000,胰蛋白酶,胎牛血清,表达载体,限制性内切酶BamH,Hind ,细胞蛋白裂解
8、液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒,兔抗小鼠Myostatin多抗,IRDye 800偶联的驴抗兔及驴抗羊IgG,羊抗小鼠GAPDH多抗。C2C12细胞的培养 C2C12细胞接种于含DMEM完全培养基的培养皿中,置于5CO2、饱和湿度、37培养箱内培养。2天换液1次。实验所用的细胞均处于对数生长期。Myostatin RNAi质粒构建 根据小鼠Myostatin mRNA序列获得3对来自Ambion公司的siRNA序列信息,按ID# 156380的序列,将碱基序列重排,经GenBank BLAST检索,不与小鼠任何基因同源,作为阴性对照的序列,根据发夹siRNA的构成方式,设计siRNA模
9、板,包含各正反义靶序列的互补DNA链、限制性内切酶BamH 、Hind 识别序列,上述4对RNAi序列由上海鼎安生物科技有限公司合成。用TE溶解siRNA模板寡核苷酸,浓度至1 g/l。 SiRNA模板核苷酸的退火:反应在灭菌的 ml离心管中进行,依次加入:sense siRNA模板核苷酸2 l, antisense siRNA 模板核苷酸2 l, 2DNA Annealing Solution 25 l,反应总体系50 l,轻轻混匀,稍加离心。90 3 min后,37 1 h,退火的siRNA模板链-20保存备用。将5 l模板链加入45 l双蒸水中,终浓度为8 ng/l。 模板链与载体的连接
10、,依次加入:10连接酶缓冲液1 l,载体1 l, 模板链1 l,T4 DNA连接酶1 l。反应总体系10 l,轻轻混匀,稍加离心。4,过夜。连接产物的转化,重组质粒的筛选,抽提,测序证实后测定A260,对质粒进行定量,-20保存备用。 Myostatin RNAi质粒转染C2C12细胞 细胞处理:转染前24 h将培养的C2C12细胞以胰蛋白酶消化,用不含抗生素的DMEM完培终止反应,接种于24孔培养板,使转染当天细胞融合达80%85。转染:四个质粒均根据lipofectamin 2000操作说明,按照1 g质粒和2 l lipofectamin 2000/孔进行转染。46小时后换生长培养基。2
11、4小时后扩至6孔培养板,继续培养至72小时,收获细胞。实时荧光定量PCR检测成肌细胞系C2C12中myostatin mRNA表达的变化 转染72h后Trizol法提取C2C12总RNA,RT-PCR合成第一链,将1l cDNA模板加入19 l 定量PCR反应液,混匀后加入专用离心管中,并设空白管、阴性对照和Myostatin或GAPDH各5个标准品对照。各反应管于荧光定量PCR仪进行扩增:94预变性2 min,然后94 20 s,60 60 s,共40个循环。根据各自标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中Myostatin或GAPDH的准确含量。为了消除样本、逆转录和PCR反应的差
12、异,以 Myostatin mRNA和GAPDH mRNA含量的比值作为评价Myostatin表达水平的指标。相同实验重复4次。Western-Blot检测成肌细胞系C2C12中myostatin表达的变化 转染72h后总蛋白提取及蛋白浓度测定: 移去培养基,以预冷的 PBS漂洗一遍。移去PBS,加入细胞蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂提取总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度。12%SDS-PAGE电泳,采用半干转移至PVDF膜,封闭后,分别采用兔抗鼠myostatin单克隆抗体或山羊抗鼠GAPDH单克隆抗体,一抗,4过夜。相应二抗为IRDye 800偶联的驴抗兔IgG,IRDye 800偶联的驴抗羊I
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