家猪百日胚胎胸腺的基因表达谱.docx
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1、家猪百日胚胎胸腺的基因表达谱【摘要】 目的: 构建家猪100 d胚胎胸腺基因表达谱,为研究胸腺的发育和分化机制奠定基础. 方法: 随机挑取家猪100 d胸腺cDNA文库的11 712个克隆,进行单向全自动大规模测序,去污染后共获得7071个高质量的表达序列标签(EST)用于基因表达分析. 结果: 对7071个高质量EST的聚类分析结果获得959个多拷贝基因和3074个单拷贝基因. 与非冗余的核酸数据库、SwissProt数据库及人、牛和鼠的Unigene数据库进行BLAST,发现806个多拷贝基因和1669个单拷贝基因与已知序列有同源性,1629个EST没有发现同源序列被认为是新基因. 根据功
2、能将已知基因归为7类,其中基因表达相关基因占%,胸腺特异的防御功能相关基因有一定程度表达,这与人婴儿胸腺基因表达谱相类似而不同于成年人胸腺组织. 将109个既发现有ORF又具有PolyA的多拷贝新基因与人类基因组框架序列进行BLAST,发现其中58个有同源序列. 结论: EST技术是发现新基因的有效手段之一;此期家猪胸腺仍处于发育阶段.【关键词】 猪;胸腺/胚胎学;EST0引言表达序列标签是从由组织、细胞mRNA构建的cDNA文库中随机取出一个克隆,从5末端或3末端对插入的cDNA片段进行单向自动测序,所获得的长约60500 bp的一段cDNA序列. 通过对EST进行分析,有助于新基因的发现和
3、克隆,为人类基因组图谱绘制、基因组编码区序列的确定、分析基因在不同组织中的表达特异性提供序列信息1,2. 目前EST技术已经广泛应用于比较基因组学、功能基因组学和疾病基因组学等研究领域,并且已经成为连接基因组学和后基因组学的桥梁和工具.胸腺是T细胞发育的场所. 淋巴样干细胞迁入胸腺进行分化,约95%以上的胸腺细胞死亡,只有不足5%的细胞存活,分化为成熟的辅助T细胞及细胞毒性T细胞,输出胸腺,定位于外周淋巴器官及组织. 在孕14 wk胚胎胸腺中交错突细胞和巨噬细胞已经出现,孕17 wk胸腺已经完全分化有各种淋巴细胞释放3. 孕1415 wk是早期胸腺细胞向普通型胸腺细胞分化的关键时期,研究此期胸
4、腺的基因表达特点有助于阐明胸腺的发育机制. 我们以家猪100 d胚胎胸腺组织cDNA文库(FTY)为材料,共投入11 712个测序反应,获得7071个高质量的EST,建立了家猪100 d胚胎胸腺组织的基因表达谱.1材料和方法材料家猪100 d胚胎胸腺cDNA文库由Division of Animal Genetics Department of Animal Science & Animal Health The Royal Veterinary and Agricultural University提供. 文库构建载体为pBluescript SK(+). ET dye terminator
5、 mix,MegaBACETM Longread Matrix,MegaBACE LPA buffer,MegaBACE1000核酸分析仪、VDS均购自Amersham Pharmacia公司;Eppendorf 5810R离心机;ABI9700 PCR仪,鼎国公司生产T7引物等.方法序列测定用碱裂解法进行测序模板制备;用ddNTP荧光标记的末端终止法进行测序反应;毛细管电泳测序.信息收集与处理basecalling软件读取胶图文件; phred程序,去除克隆中的低质量部分4,5;phd2fasta软件将PHD格式文件转化为FASTA格式的文件;crossmatch软件通过与载体序列数据库进行
6、比较后进行载体屏蔽,提取每一克隆中无载体污染的最长片段,提取出超过100 bp的形成新的高质量克隆.聚类分析利用Phrap软件,对cleaned ests进行聚类,得到多拷贝基因及单拷贝基因,合起来称作Unigenes.数据比较将得到的Unigenes与Genbank中非冗余核苷酸库进行比较,blastn标准(e值=1e-10)与Genbank中的蛋白质数据库进行blastx比较, blastx标准(e=1e-5),与Genbank中的Unigene人、牛、鼠数据库进行比较(e=1e-10);利用比对结果去除线粒体、细菌基因组、重复序列和核糖体RNA;对聚类后的Unigenes进行ORF预测及
7、加尾信号分析;将未在数据库中发现同源性的Unigenes与人类基因组序列进行BLAST(默认参数).2结果文库质量评估共投入11 712个反应,经过去污染和低质量序列,获得高质量EST共7071个, EST平均读长为427 bp. 将ESTs与线粒体基因、人重复序列数据库、细菌基因组库、人核糖体RNA库进行了同源性比较,得到线粒体基因19个(244个克隆),占%,核糖体基因1个,占%,重复序列4个,占%,基因组DNA 9个,占 %,新基因和新EST 1629个,占%,其他已知基因5112个克隆,占%.聚类分析使用Phrap软件进行聚类分析,得到4033个基因聚类,包括3074个singlet基
8、因和959个多拷贝基因;将cluster序列与nr库,SwissProt库及Unigne库比较,得到2013个已知基因,其中singlet基因为1670个,多拷贝基因为805个;未知基因为1629个.其中表达量最多的一个基因为:牛延长因子11 alpha(Bos taurus EF1A mRNA for elongation factor 1 alpha),其次为猪G蛋白基因,含42个拷贝数. 由于测定的是未经均一化处理的cDNA文库,我们得到了这一特定时期猪胸腺组织EST表达的信息,获得此文库内所表达的基因类型,还可研究表达基因的丰余度和组织特异基因表达的信息.结果的种属比较获得的人类的注释
9、最多,猪类的其次,牛的第三,鼠类的最少. 虽然存在人的EST数据要远远多于其他物种的原因,但鼠的数据远多于牛,依然得到了多于鼠的注释,由此推测猪和人的同源性最高,猪和牛的同源性较鼠要近.表1种属比较(略)表达谱的构建根据Blast结果,利用Genbank Accession No.为索引,构建FTY已知功能基因的表达谱. 所有已知基因按功能分为以下7大类1:细胞分裂、信号传导或传递、结构和运动、细胞和机体防御、基因和蛋白表达、代谢和未分类.表2已知基因的分类(略)从Tab 2可以看出,在这7 大类的功能基因中,参与基因表达的克隆数在已分类的功能基因中含量最为丰富,提示100 d的猪胸腺组织生长
10、旺盛,而胸腺分化标志性的免疫防御功能的基因数量很少. 从各类功能分类的基因数目来看,参与基因表达的基因数目明显少于所测定的克隆数,这种基因的高度冗余说明基因表达功能的实现所需基因种类局限,而其相关基因转录活性增强是增强基因表达的途径.与胸腺有关的基因的表达在对已知基因进行分类的过程中,还同时检测了与胸腺功能相关的基因,其中Thymosin基因有67个EST,61个EST代表TCR基因,10个EST代表CD3基因,2个EST代表CD8. 造血相关基因的表达提示此期胸腺与造血功能相关.3讨论文库质量检测cDNA文库的质量对于EST序列测定尤其是大规模EST序列测定是至关重要的6,7. 文库的质量取
11、决于文库滴度和插入片段大小,文库滴度对于所构建cDNA文库来说是首要的判断指标,文库滴度过低,则文库含有的组织内表达基因的特异性和代表性就会受到质疑. 文库的质量主要经小规模测序,对蓝白斑筛选结果、重组率、测序质量和污染情况及聚类分析结果等评估获得. 插入片段要求大于500 bp.本试验采用文库通过了质量检测,未进行均一化处理,包含了100 d猪胚胎胸腺的基因表达的信息, FTY大规模EST序列测定共进行了11 712个反应,大于100 bp的高质量克隆(Q20)数量为7071,平均读长为427 bp,获得真实的功能基因表达谱.和数据库同源性比较目前,大规模序列测定是EST序列增长的主要源泉.
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