土壤宏基因组来源新型四环素...t(64)的表达及功能鉴定_荣宇凤.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）作者简介：荣宇凤，硕士研究生。通信作者：冯治洋，教授，研究方向为微生物次级代谢，：。荣宇凤，王绍琛，卫林，等 土壤宏基因组来源新型四环素破坏酶基因（）的表达及功能鉴定 南京农业大学学报，（）：，（），（）：土壤宏基因组来源新型四环素破坏酶基因（）的表达及功能鉴定荣宇凤，王绍琛，卫林，高月皎，吕云斌，冯治洋（南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京）摘要：目目的的 本文旨在研究土壤宏基因组来源的新型四环素破坏酶（）的耐药机制并分析（）的基因环境，为（）基因的传播及抗生素和佐剂的研发奠定基础。方方法法 利用体外生化反应验证（）降解四环素的功能，通过液相色谱质谱联用（）分析降解产物，结合序列比对、系统发育树构建、分子对接等生物信息学方法推测（）中与四环素结合的重要氨基酸残基，解析（）的耐药机制和（）基因的水平转移风险。结结果果 克隆的序列分析发现（）上游存在 插入序列，暗示（）基因具有潜在的水平转移风险。（）属于黄素依赖型单加氧酶，与首次发现的四环素破坏酶（）仅有 的序列一致性，与最近发现的一系列土壤来源四环素破坏酶（）（）也只有 左右的序列一致性。三维建模发现（）与土壤来源的（）具有相似的结构，包含 个四环素结合域、个 结合域以及连接上述 个结构域的 个 螺旋。体外生化试验发现（）降解四环素后产生了 个特异产物，均为，与（）催化产物一致。推测反应中四环素 位点被羟基化，破坏了 和 组成的 二酮区域，导致四环素不能螯合镁离子而失去抗菌活性。结结论论 鉴定了土壤来源的新型四环素破坏酶（）的四环素降解功能，初步解析了（）的耐药机制。关键词：四环素破坏酶；生化分析；耐药机制；分子对接中图分类号：文献标志码：文章编号：（）（），（，）：（）（）（），（）（）（），（），（），（）（）（），（）（），（），（），（）（），（），（）：；南 京 农 业 大 学 学 报第 卷四环素自 年从金色链霉菌（）中被发现以来，由于其抗菌活性广和价格低廉等优点，被广泛应用于疾病治疗和农牧业生产。由于四环素的不规范使用给环境中的微生物造成了选择压力，导致四环素耐药基因在不同菌株之间传播，甚至促进耐药基因的进化，威胁到新一代四环素类抗生素的使用。四环素耐药机制以外排泵蛋白如（）和核糖体保护蛋白如（）为主，而大多数抗生素最主要的耐药机制是酶修饰，如介导氨基糖苷类抗生素和 内酰胺类抗生素耐药的乙酰基转移酶和超广谱 内酰胺酶，但四环素的酶修饰机制很少被报道。很久以来，（）都作为唯一一个被发现的能降解四环素的酶，直到近年来报道了一系列来源于土壤宏基因组文库的四环素破坏酶，四环素的酶修饰机制才引起了人们更多的注意。目前报道的四环素破坏酶都属于黄素依赖型单加氧酶（）。在自然界很常见，并且参与很多氧化还原反应，包括一些聚酮化合物的修饰。四环素破坏酶按来源分为 类：在肠道等环境中发现的（）及其变体以及在土壤环境中发现的四环素破坏酶（）（）。这 类四环素破坏酶的基因序列相似性较低，但是具有保守的三级结构，包括 个底物结合域和 个黄素腺嘌呤二核苷酸（）结合域。不同的是（）及其变体只有 个 螺旋连接底物结合域和 结合域，而土壤来源的四环素破坏酶有 个 螺旋连接上述 个结构域。三级结构的差异也导致了功能的不同，（）及其变体能降解所有的四环素类抗生素，包括美国食品药品监督管理局（）最新批准的第四代抗生素艾拉环素和奥马达环素。而土壤来源的四环素破坏酶只能降解第一代四环素，说明四环素破坏酶基因可能起源于环境微生物，后来才转移到不同的宿主并且在抗生素的压力下发生了进化。临床上发现的大部分耐药基因都起源于环境微生物，耐药基因可以通过质粒、转座子等从非致病菌水平转移至人类病原体，这将会给临床抗感染治疗造成极大的威胁，因此有必要对耐药基因的来源、耐药机制以及传播机制进行研究，从根源上阻止耐药基因的水平转移并为新型抗生素或佐剂的研发奠定基础。因此，本试验对前期发现的一个土壤来源的四环素破坏酶进行深入研究，根据四环素耐药基因的命名规则将其命名为（），并对四环素破坏酶（）进行表达及功能鉴定，初步解析其耐药机制，为监测四环素破坏酶基因的传播及抗生素和佐剂的研发奠定基础。材料与方法 试验材料与仪器供试菌株 、.（）、（）均由本课题组保存。是通过功能宏基因组学方法筛选到的四环素阳性克隆，我们将四环素破坏酶基因（）（登录号：）克隆到（）表达载体上并将其蛋白命名为（）。液体培养基：胰蛋白胨 ，酵母粉 ，氯化钠 ，超纯水定容至 。培养基：称取 肉汤粉末，超纯水定容至 。四环素、土霉素、阿米卡星、链霉素、新霉素均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；替加环素购于南京迈博生物科技有限公司；卡那霉素购于上海捷瑞生物工程有限公司；和 购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；磷酸葡萄糖二钠购于南京梅林学海生物科技有限公司；核黄素腺嘌呤二核苷酸二钠和 磷酸葡萄糖脱氢酶购于南京安卓生物科技有限公司；购于南京迈博生物科技有限公司；质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶 回收试剂盒购于诺唯赞生物科技股份有限公司。基因扩增仪购于珠海黑马医学仪器有限公司；恒温培养箱购于上海申安医疗器械有限公司；琼脂糖凝胶电泳仪购于北京六一生物科技有限公司；超净工作台购于苏洁净化设备有限公司；高效液相色谱仪（）和液相色谱质谱联用仪（）购于日本岛津公司。试验方法 克隆测序及基因注释 为携带四环素破坏酶基因（）的土壤宏基因组文库克隆，克隆测序由南京擎科生物科技有限公司利用 平台 测序仪完成。将 序列上传至（：）进行分析，确定其开放阅读框架（，）。利用 对（）上、下游基因进行比对分析，基因序列以登录号 保存在 数据库中。第 期荣宇凤，等：土壤宏基因组来源新型四环素破坏酶基因（）的表达及功能鉴定最小抑菌浓度（）测定根据美国临床和实验室标准协会（，）的文件 进行药物敏感性试验测定，采用微量肉汤稀释法测定 对四环素类和氨基糖苷类抗生素的最小抑菌浓度，质控菌株为.，对照菌株为含有 质粒的.。将菌株接种至 液体 培养基中，在 、摇床培养 。按（体积分数）的接种量将菌液接种至 培养基中，培养至 麦氏浊度，再用 液体培养基将菌液稀释 倍备用。用 液体培养基将四环素、土霉素、替加环素、阿米卡星、链霉素、庆大霉素和新霉素母液稀释 个浓度梯度（注意四环素和替加环素在操作过程中需要避光）。在 孔板中依次加入浓度由高到低的抗生素 ，再加入 稀释后的菌液，每个编号设置 个重复。将 孔板置于 培养箱中培养 ，观察结果。未检测到细菌生长的最低抗生素浓度为。四环素破坏酶氨基酸多序列比对及系统发育树的构建 将四环素破坏酶的氨基酸序列用 进行多序列比对，将比对结果上传至 （：）进行分析，再根据 法用 软件构建系统发育树。四环素破坏酶的表达与纯化对四环素破坏酶基因（）用引物（）和（）进行 扩增，克隆到（）表达载体上，再电转至表达宿主.（）中。挑取单克隆接种至含有 四环素、卡那霉素和 异丙基硫代半乳糖吡喃糖苷（）的液体 培养基中，于、摇床培养。按的接种量接种至 含有卡那霉素的液体 培养基中，摇床培养至 值为。加入 至终浓度 ，在、诱导。将诱导后的菌液倒入预冷的离心瓶中，于 、离心 。弃上清液，向菌体中加入 蛋白裂解液进行超声波破碎。条件为：在 功率下破碎 ，间歇 ，共 。将破碎后的蛋白于 、离心 得到酶粗液，通过镍离子亲和层析柱进行纯化。具体纯化过程：先用 个柱体积蛋白质裂解液平衡柱子，再用 个柱体积洗涤缓冲液洗去杂蛋白，最后用 个柱体积洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来。根据目的蛋白的大小，选择拦阻相对分子质量 的蛋白超滤管将蛋白浓缩至 ，测定蛋白浓度。四环素破坏酶的体外反应 根据 等的方法进行体外反应以验证四环素破坏酶的功能。体外反应体系包括：缓冲液（）、不同浓度的四环素、纯化的四环素破坏酶、以及 再生系统。其中 再生系统包括：磷酸葡萄糖、以及 磷酸葡萄糖脱氢酶。在加入底物和酶反应之前，再生系统先在 反应 以生成四环素破坏酶在体外反应过程中所需要的，应注意 磷酸葡萄糖和 在 三（羟甲基）甲基氨基丙烷磺酸（）缓冲液中混合以后的 值应为。分别设置不同的反应时间梯度和浓度梯度，不添加酶而其他条件相同的反应作为空白对照，体外反应结束后加入等体积甲醇和 。最后用 仪检测底物四环素的变化以及反应产物。检测条件：流动相为；色谱柱为 ，；进样为 ；流速为 。检测程序：，；，。分析四环素破坏酶体外反应产物用 仪对体外反应样品进行分析，以确定底物及反应产物的保留时间及质荷比（）。设置检测波长为 和 ，因为四环素在这 个波长下有吸收。条件：流动相为；进样为 ；流速为 。检测程序：，；，。四环素破坏酶三维结构预测及分子对接在 网站（：）上传（）氨基酸序列，选择四环素破坏酶（）（编号）作为模板进行三维建模。利用 软件将预测的（）三维结构与（）、（）（编号）的晶体结构进行重叠比较。采用殷赋云计算平台（：）的 方案完成分子对接计算。化合物四环素在 力场下进行能量最小化获得三维结构，从 数据库获取（）和金霉素的共晶结构（编号，分辨率；）。以晶体配体定义结合口袋，采用 程序进行半柔性对接，采用 打分函数进行能量评价。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 （）上、下游基因图示.（）分别表示。，结果与分析 四环素破坏酶基因的环境分析对 克隆中（）及上、下游基因进行功能注释（图 和表）。结果表明，（）虽然与 来源的四环素破坏酶有 的最高一致性，但该酶未见具体的研究报道，而与（）一致性最高的已知功能的四环素破坏酶为土壤宏基因组来源的（），具有 一致性。在（）的上游发现了 个 家族的转座酶，与.来源的 家族的转座酶具有 一致性。现在已有证据表明 家族的转座酶能介导耐药基因的水平转移，这也预示着四环素破坏酶基因（）具有在不同菌株之间传播的风险。另外，在 （）的下游发现了一个双功能乙酰基转移酶基因，与 来源的双功能乙酰基转移酶（）一致性最高，为，但该类双功能乙酰基转移酶的功能还没有被表征过，说明宏基因组学是挖掘新型耐药基因的有效手段，同时也表明 可能介导多种抗生素产生耐药性。其他基因的分析未发现与细菌耐药相关的特性。表 （）上、下游基因分析 （）基因氨基酸 同源蛋白功能 来源一致性 同源蛋白序列号 假定蛋白 海洋假丝酵母 假定蛋白 副衣原体科细菌 内切葡聚糖酶 副衣原体科细菌 纤维素合酶 副衣原体科细菌 假定蛋白 副衣原体科细菌 假定蛋白 副衣原体科细菌 丝氨酸蛋白激酶 互营细菌 抗 因子 副衣原体科细菌 磷酸酶 副衣原体科细菌 未发现相似蛋白 硫氧还蛋白 副衣原体科细菌 转座酶 大肠杆菌 转座酶 大肠杆菌 四环素破坏酶 疣微菌 双功能乙酰基酶 疣微菌 蛋白激酶 嘉利翁氏菌 对各抗生素的最小抑菌浓度分析 对各抗生素的最小抑菌浓度测定结果如表 所示，质控菌株的 均在 规定的范围之内。对四环素及土霉素的 均为 ，根据 文件判定该菌株对四环素及土霉素表现出耐药性（）。对替加环素表现出敏感（），推测这与（）的空间结构有关，相较于（），（）含有 个额外的 螺旋，而土壤来源的四环素破坏酶中第 个螺旋阻碍了其与替加环素的结合，影响了底物特异性。另外，对阿米卡星的 为 ，对链霉素的 高达 ，对新霉素、庆大霉素和安普霉素的敏感性也有所降低，推测是由于（）下游的乙酰基转移酶基因介导了氨基糖苷类抗生素耐药表型。第 期荣宇凤，等：土壤宏基因组来源新型四环素破坏酶基因（）的表达及功能鉴定表 最小抑菌浓度（）（）菌株四环素土霉素替加环素阿米卡星链霉素新霉素庆大霉素安普霉素 .四环素破坏酶氨基酸多序列比对与系统发育树分析（）是第一个被报道的四环素破坏酶，来源于脆弱拟杆菌，而本试验在土壤宏基因组文库中发现的四环素破坏酶（）与（）仅有 的一致性。氨基酸多序列比对结果显示四环素破坏酶都含有结合黄素腺嘌呤二核苷酸（）所必需的保守基序（图），说明（）降解四环素的过程需要 的参与。（）和土壤来源的四环素破坏酶（）（）一致性更高，而与（）及其变体一致性较低。其中，（）与（）一致性最高，达，而与（）一致性最低，为。另外，从系统发育树（图）可以看出，对四环素有修饰作用的酶分为 类（在系统发育树上聚成 簇），第 类是肠道来源的（）及其变体，第 类是土壤来源的（）（）。（）与土壤来源的四环素破坏酶（）亲缘关系最近，处于同一分支。由于土壤来源的四环素破坏酶与（）及其变体的氨基酸序列相似性很低，根据序列同源性很难预测其，因此在很长一段时间内土壤中存在的四环素破坏酶基因都被忽略了，推测土壤环境中可能还存在一些未知的四环素破坏酶基因。图 四环素破坏酶氨基酸序列比对.圆点表示分子对接中（）与四环素之间存在氢键作用的氨基酸残基。（）四环素破坏酶（）的表达与纯化产物分析利用含（）（）质粒的（）重组菌诱导表达目的蛋白。由于目的蛋白引入了组氨酸（）标签，能与镍离子可逆性结合，所以在镍离子亲和层析柱纯化的时候能使目的蛋白与杂蛋白分南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 基于四环素破坏酶氨基酸序列构建的系统发育树.图 （）聚丙烯酰胺凝胶电泳.（）开。最后用含有 咪唑的洗脱缓冲液洗脱，得到纯化的目的蛋白。由于体外反应需要的蛋白浓度较高，且反应时需要替换成 ，所以本试验选择拦阻相对分子质量为 的蛋白超滤管进行浓缩。最后用 分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白，结果如图 所示，与预测的目的蛋白相对分子质量 一致。体外反应产物分析四环素破坏酶（）属于黄素依赖型单加氧酶，所以体外反应时需要额外添加辅酶 以及 作为递氢体。由图 可见：反应 时，产生了明显的特异产物峰，随着反应时间的延长，底物四环素没有明显减少，产物也没有继续积累。但当反应时间一致（均反应 ），且底物浓度不一样时，底物四环素有明显的减少（图）。在底物浓度为 时，四环素基本被完全消耗，产生了 个特异产物峰。选择四环素浓度为 、反应 的样品进行 分析，发现 个体外反应特异产物的 均为（图）。（）虽然与土壤来源的四环素破坏酶（）一致性最高，但是（）催化四环素降解的过程中不仅形成了 为 的产物与（）一致，还形成了 为 的产物，因此推测（）的反应产物与（）一致。在（）的作用下，四环素 位点被羟基化（图），羟基化四环素不能稳定存在，在酸性条件下会形成 所示的“氧桥”结构。能在非酶催化下转变为，但 是混合物，至今没有被成功分离。和 组成的 二酮区域能螯合金属镁离子，该位点与镁离子的结合对于将四环素运输至胞内并且和靶位点 核糖体的结合至关重要，所以四环素 二酮区域的破坏导致了其抗菌活性的丧失。四环素破坏酶三维建模与分子对接分析土壤来源和肠道来源的四环素破坏酶之间序列相似性比较低，但是三级结构较为相似。如图 所示：（）只有 个 螺旋连接四环素结合域和 结合域，而土壤来源的（）和（）都有 个螺旋连接四环素结合域和 结合域。分子对接结果（图）表明，以及 分别与四环素 环上氨基和羟基形成氢键相互作用，而、以及 与四环素 环的碳原子形成疏水相互作用。与底物四环素结合时，的活性异丙嗪部分靠近底物而远离腺苷，催化反应完成后，构象发生变化并开始进行下一轮的底物结合。第 期荣宇凤，等：土壤宏基因组来源新型四环素破坏酶基因（）的表达及功能鉴定图 （）体外反应产物的 分析.（）不同反应时间；不同四环素浓度。圆点表示反应产物；：四环素。；：图 （）体外反应产物 图谱.（）图 推测的（）催化四环素降解的反应.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 四环素破坏酶（）与四环素的分子对接图.（）图 （）、（）和（）的三维（）结构重叠图.（），（）（）蓝色表示（），粉红色表示（），橙色表示（）。（），（），（）讨论抗生素生产菌在产生抑制其他细菌生长的抗生素的同时，必定会产生一些自我保护机制来逃避抗生素的作用，因此这些细菌中携带了大量天然存在的耐药基因。四环素是放线菌次级代谢产生的天然产物，曾作为动物的促生长剂被广泛应用于农业生产，造成的抗生素选择压力会促进耐药基因的进化和传播。土壤微生物是最大的抗生素耐药基因储存库之一，许多临床相关的耐药基因都起源于环境微生物，因此有必要对土壤耐药基因组中的耐药基因进行监测，在其传播到临床之前做好预警。从分子水平上对耐药机制进行研究可以指导新型抗生素的开发以及对现有抗生素进行改造，从而缓解临床上严重的耐药性威胁。本研究药物敏感性试验结果显示，（）对四环素的 为 ，但是（）对替加环素表现出敏感，这是由（）的空间结构决定的。（）含有 个 螺旋连接四环素结合域和 结合域，第 个 螺旋阻碍了 位置含有长侧链的替加环素进入其底物结合位点。而（）由于第 个螺旋的缺失，导致底物结合位点广泛暴露，因此（）能与替加环素结合。（）和（）只有的一致性，通过体外生化反应和 分析推测（）降解四环素的产物与（）一致。在催化过程中，以 种构象和四环素破坏酶结合，种构象的切换对底物的催化至关重要。构象时，四环素破坏酶和四环素结合，的活性异丙嗪部分远离腺苷而靠近底物四环素。催化反应完成后，从底物结合位点翻转切换成 构象。构象的变化使催化产物能释放出来并且进行下一轮的底物结合。目前报道的土壤来源的四环素破坏酶很少，只有（）（），本试验更加证实了土壤环境中可能还存在着一些未知的四环素破坏酶基因。等在人类病原体 中发现了与（）同源的四环素破坏酶（），并且已经证实（）能在.异源表达并且表现出高水平四环素抗性，表明 很有可能成为土壤和临床之间抗生素抗性交换的桥梁。本试验在（）的上游发现了 家族的转移元件，下游紧连着一个氨基糖苷类抗生素耐药基因，这与耐多药移动遗传元件的特点有些相似，也从侧面说明（）具有潜在的传播风险。本研究基于体外酶反应和三维结构分子对接初步阐述了（）与四环素作用的关键氨基酸残基和反应过程，未来对（）与四环素的复合晶体结构的研究将会更清晰揭示（）的耐药作用机制，为新药开发提供依据。参考文献：，（）：第 期荣宇凤，等：土壤宏基因组来源新型四环素破坏酶基因（）的表达及功能鉴定，（）（），（）：，（）：，（），：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，（），：，（），（）：，（）：，（）：，：，（），：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：责任编辑：范雪梅