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姜黄素、姜黄素与大黄素联用抗肝纤维化作用的实验研究
【摘要】　目的探讨姜黄素、姜黄素与大黄素联用的抗肝纤维化作用。方法以二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型，造模结束后，分别给予姜黄素、姜黄素与大黄素联用进行 治疗 ，检测肝功能、肝纤维化血清学指标，肝SOD、MDA和Hyp水平，取肝组织固定，HE、VG胶原染色，光镜观察肝组织的病理变化以及α-平滑肌在肝脏的表达。结果姜黄素、姜大联用能明显降低肝纤维化大鼠血清ALT，AST，TNF-α，HA，LN，PCIII含量，降低肝组织MDA、Hyp含量，升高SOD水平。病理组织观察表明，姜黄素、姜大联用能减轻肝细胞坏死，抑制纤维组织增生，改善肝组织结构，抑制α-SMA在肝内的表达。结论姜黄素、姜大联用具有良好的抗肝纤维化作用。
　　【关键词】　姜黄素 大黄素 肝纤维化
　　姜黄素、大黄素分别是温郁金、姜黄和虎杖的所含成分之一。姜黄素具有广泛的药理活性，能抗氧化、抗炎，抑制肝星状细胞的活化和增殖，而大黄素亦有上述作用。初步研究表明，姜黄素、大黄素能预防肝纤维的形成，以郁金、虎杖为主组成的复方虎金颗粒［1］具有良好的抗肝纤维化作用。为阐明中药复方产生效用的物质基础，我们探讨了姜黄素、姜黄素与大黄素联用对肝纤维化的治疗作用。
　　1 材料
　　动物SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重g，购自广州中医药大学实验动物中心，普通大鼠饲料喂养。
　　药物姜黄素、大黄素，均购自陕西旭煌植物科技有限公司，经HPLC检测纯度达90%以上，使用前用%羧甲基纤维素钠配制成不同浓度的混悬液。水飞蓟素，德国马博士大药厂生产，临用时用蒸馏水配成/ml的供试品液。
　　试剂DMN购自日本株式会社，使用前用生理盐水配成%溶液备用。HA，LN，PCIII由北京北方生物技术研究所提供；TNF-α测试盒由北方生物试剂研究所提供；SOD，MDA，Hyp，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。甲醛、苏木素、伊红、酸性品红、戊二醛等。
　　仪器7060型全自动生化分析仪、SN-695B型放免γ测量仪，上海原子核研究所日环仪器厂。UV-754型分光光度计，BX50显微镜，Olympus 公司，2035石蜡切片机，德国Walldorf 公司；E 990数码摄像机，Nikon公司。
　　2 方法
　　分组、造模及给药随机取SD大鼠8只为正常对照组。其它大鼠进行造模。将1 ml DMN原液溶于200 ml生理盐水中，配制%DMN溶液，避光保存，2周内使用。参照 文献 ［2］给药，每只大鼠给予%DMN腹腔注射，第1周前3 d连续给2/3药量，后4 d不给药，第2周开始前3 d连续给全药量，后4天不给药，持续4周。正常对照组则给予相同量的生理盐水腹腔注射。造模结束后，将存活的大鼠随机分为6组，分别为模型对照组、水飞蓟素组、姜黄素高、低剂量组和姜大联用高、低剂量组,每组8只。正常对照组和模型对照组灌胃蒸馏水，水飞蓟素组用药量分别为人剂量的5倍，即 g/kg，姜黄素给药剂量为100 mg/kg和200 mg/kg，姜大联用剂量分别为50，10和100，20 mg/kg。灌胃1次/d，每周灌6 d。治疗4周后，实验结束。眼眶采血，分离血清，留取肝左叶固定。
　　观察指标及方法①观察大鼠一般状态包括：饮食变化、行为及毛发改变等；②全自动生化分析仪检测大鼠血清ALT，AST，TP，ALB，A/G；③放免法检测HA，LN，PCIII，TNF-α含量；④肝组织标本HE和VG胶原染色，光镜观察；⑤α-SMA免疫组化染色：常规SABC法染色，DAB显色。
　　肝胶原增生程度、肝纤维化分级采用Ishak法［3］0级：无肝纤维化；1级：纤维组织向部分汇管区扩大，伴有小纤维间隔；2级：纤维组织向大部分汇管区扩大，并伴有小纤维间隔；3级：纤维组织向汇管区扩大，并伴汇管区与汇管区桥接；4级：纤维组织向汇管区延伸，并有明显的汇管区与汇管区、汇管区与中央小叶区桥接；5级：纤维形成明显的汇管区与汇管区、汇管区与中央小叶区桥接，间或有假小叶形成；6级：肝内布满小圆形假小叶，假小叶内有粗大增生的胶原纤维。
　　方法计量资料以均数±标准差±s表示，采用F检验，两两比较用q 检验，用统计进行分析；计数资料采用Ridit分析。
　　3 结果
　　姜黄素、姜大联用对大鼠一般情况的影响正常对照组大鼠生长状态良好，体重增加显着，皮毛光滑，二便如常；大鼠注射DMN后，活动少，精神萎靡，喜睡少动，体重不增加甚至较前下降，尿黄，有腹泻，大鼠发生腹水产生率达70%。经姜黄素、姜大联用治疗后大鼠一般状态明显好于模型组，腹水的发生率明显降低。
　　姜黄素、姜大联用对肝纤维化大鼠血清ALT，AST，TP，ALB，A/G的影响结果如表1。
　　从表1可以看出，经DMN造模后，大鼠血清中ALT、AST的含量升高，TP，ALB，A/G的含量明显下降，与正常对照组比较均差异显着；经姜黄素、姜大联用治疗后，各组大鼠血清中ALT及AST的水平有不同程度降低，TP、ALB、A/G均有升高，与模型组比较有显着性差异，且存在一定的量-效关系。
　　姜黄素、姜大联用对肝纤维化大鼠血清PCIII，HA及LN，TNF-α含量的影响 结果见表2。
　　表1 姜黄素、姜大联用对肝纤维化大鼠血清ALT，AST，TP，ALB及A/G的影响
　　与正常对照组比较，**；与模型组比较，Δ,ΔΔ；n=8
　　表2 姜黄素、姜大联用对大鼠血清PCIII，HA，LN，TNF-α含量的影响
　　与正常对照组比较，**；与模型组比较，Δ,ΔΔ；n=8
　　从表2可以看出，使用DMN造模后，各组大鼠血清中HA，LN，PCIII，TNF-α含量明显升高，与正常对照组比较有显着性差异；经姜黄素、姜大联用治疗后，大鼠血清中HA，LN，PCIII，TNF-α明显降低，与模型组比较，差异显着。
　　姜黄素、姜大联用对大鼠肝组织SOD，MDA，Hyp含量的影响结果见表3。
　　表3 姜黄素、姜大联用对大鼠肝组织SOD，MDA，Hyp含量的影响
　　与正常对照组比较，**；与模型组比较，Δ,ΔΔ；n=8
　　从表3看出，DMN造模后，各组大鼠肝组织中MDA及Hyp的含量明显升高，SOD的含量降低，与正常对照组比较有显着性差异；经姜黄素、姜大联用治疗后，各治疗组大鼠肝脏组织中MDA、Hyp的含量降低明显，SOD含量上升，与模型组比较差异显着。
　　病理观察结果
　　肉眼观察正常对照组大鼠肝脏呈红褐色，表面光滑，质软，颜色正常；模型组大鼠肝萎缩，表面较粗糙，色晦暗，部分肝表面有细小结节，质硬。姜黄素、姜大联用组肝组织略变小，表面欠光滑，质地较韧，颜色偏暗，均较模型组为轻。各组大鼠腹水发生、肝表面颗粒出现情况见表4。
　　表4 姜黄素、姜大联用对大鼠腹水、肝脏表面颗粒的影响
　　从表4可以看出，正常对照组大鼠未见腹水发生，肝脏表面无颗粒形成，模型组大鼠腹水发生率达%，肝表面全部出现颗粒。经姜黄素、姜大联用干预后，二者的发生率均有不同程度的下降。
　　HE染色观察正常对照组肝小叶结构正常，肝窦无扩张出血，汇管区及中央静脉血管壁清晰可见，管壁无增厚，管周无胶原纤维可见；模型组可见肝结构被破坏，肝小叶结构、肝索排列均紊乱，部分肝细胞肿胀，肝小叶中央区明显坏死，胶原纤维增生显着，部分形成假小叶；水飞蓟素组可见肝小叶样结构较正常，肝细胞体积略增大，有少量纤维组织增生，纤维化程度轻于模型组；姜黄素低剂量 治疗 组可见肝组织结构有一定的改善，肝小叶中央区可见肝细胞坏死，汇管区炎性细胞部分浸润，有少量纤维组织增生，未见假小叶形成；姜黄素高剂量治疗组肝小叶结构基本完整，炎性反应及坏死减轻，纤维组织增生不明显；姜大联用低剂量组肝组织结构改善较明显，未见肝细胞坏死，汇管区炎性细胞部分浸润，有少量纤维组织增生；姜大联用高剂量治疗组肝小叶结构基本完整，纤维组织增生不明显。
　　VG染色观察正常对照组肝小叶结构正常，可见极少量胶原纤维主要分布于汇管区和中央静脉周围。模型组肝小叶结构被破坏，肝索排列紊乱，肝小叶被纤维间隔分割，形成大小不等的假小叶，由胶原纤维构成的纤维间隔完全或部分包绕假小叶，肝窦内呈现连续或断续性环状胶原沉积。水飞蓟素组肝小叶正常结构被破坏，界板不完整，间质胶原纤维较少，比模型组程度轻。姜黄素低剂量治疗组：肝内有少量纤维组织增生，未见假小叶形成；姜黄素高剂量治疗组肝组织肝小叶结构基本完整，可见肝汇管区周有纤维组织增生。姜大联用低剂量组肝组织结构改善较明显，有少量纤维组织增生；姜大联用高剂量治疗组肝小叶结构基本完整，有少许纤维组织增生。各组肝胶原增生程度见表5。
　　表5 姜黄素、姜大联用对大鼠肝纤维组织增生的影响
　　与正常对照组比较，**；与模型组比较，Δ,ΔΔ；n=8
　　各组肝纤维化大鼠α-SMA表达结果正常对照组未见非特异性阳性灶，仅见血管壁少量α-SMA阳性表达。模型组α-SMA阳性表达细胞数明显增多，胞浆呈棕黄色，主要分布于门静脉、汇管区、纤维间隔和邻近的肝窦，阳性灶连成片，着色强烈，弥漫整个肝小叶。姜黄素、姜大联用各组汇管区、纤维间隔和邻近的肝窦阳性细胞数目显着减少，胞浆阳性染色程度显着减轻。
　　4 讨论
　　肝纤维化是指肝脏内纤维结缔组织异常增生。各种原因导致肝细胞损伤后，释放一系列细胞因子激活HSC，被认为是肝纤维化发生的中心环节［4］。目前尚缺乏有效的治疗药物，我国传统中药所含成分由于其确切的抗肝纤维化作用，低廉的价格和较少的副作用日益受到重视。
　　本实验研究采用DMN诱导肝纤维化模型，该模型具有HSC活化明显、所致纤维化呈渐进性、不随诱因去除而自行停止，有利于观察肝纤维化的程度［5］，是筛选抗肝纤维化药物的方便模型。脂质过氧化损伤是DMN诱导大鼠肝纤维化形成的重要机制，测定MDA在组织中的含量可反映肝细胞膜脂质过氧化强弱和肝脏受损程度；SOD是自由基清除剂，可抑制自由基启动的脂质过氧化反应。抗氧化剂对DMN诱导的肝纤维化模型动物具有治疗作用［6］。测定肝水解后Hyp含量可显示胶原蛋白在肝脏中的含量；直接测定肝组织中的Hyp含量，可反映肝纤维化程度。HA、LN、PCIII联合检测有利于肝纤维化的早期诊断，与肝纤维化活动水平及程度呈正相关。
　　姜黄素具有广泛的药理活性，如抗氧化、抗炎、保肝等，能保护肝损伤，抑制肝脏炎症反应，能抑制HSC活化、增殖，抑制胶原合成［7～8］。大黄素具有抗有丝分裂作用，是酪氨酸激酶抑制剂，也具有多种药理活性，如抗菌、免疫抑制、保肝和抗炎等［9～10］。体外研究表明，大黄素能干预的HSC增殖、胶原合成，对HSC细胞周期有阻滞作用，能抑制HSC α-SMA和PDGFRβ的表达［11］。水飞蓟素［12］具有抗氧化、抑制HSC激活和下调TIMP-1的表达，体内外研究证实，水飞蓟素能减少胶原沉积。
　　本实验研究表明，姜黄素、姜大联用具有保护肝功能、降低大鼠血清肝纤维化指标，提高SOD活性、降低MDA含量，具有抗氧化作用。姜黄素、姜大联用抑制肝纤维化大鼠腹水生成、肝表面颗粒方面均有一定作用。模型组大鼠腹水发生率达%，各只大鼠肝表面均可见颗粒，而姜黄素组尤其是姜大联用组对此抑制作用明显，腹水发生率显着降低。病理组织观察，姜黄素、姜大联用各剂量组均能不同程度减轻肝细胞坏死，姜黄素、姜大联用高剂量组均能明显抑制肝纤维化大鼠肝纤维增生，促使肝小叶结构恢复。α-SMA被认为是HSC活化的标志［13］，模型组α-SMA阳性表达细胞数明显增多，阳性灶连成片，弥漫整个肝小叶。而姜黄素、姜大联用各组汇管区、纤维间隔和邻近的肝窦阳性细胞数目显着减少，胞浆阳性染色程度显着减轻，表明二者能显着抑制HSC的增殖。
　　研究中药所含化学成分、有效成分联用有助于探讨中药复方作用的物质基础。本实验中，在大黄素治疗肝纤维化的研究基础上，我们探讨了姜黄素及姜大联用对肝纤维化模型大鼠的治疗作用，二者疗效相似，这主要与联用剂量有关，但姜大联用组效果优于姜黄素组，我们将进一步探讨姜黄素、姜大联用体内外抗肝纤维化的作用机理，阐明复方作用的有效组分。
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