植物内生菌发酵培养基的初探.docx
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1、植物内生菌发酵培养基的初探【摘要】 从高活性菌株到获得高产量活性产物之间,发酵是一个重要环节。本研究设计4种内生菌发酵培养基,对89株分离自傣药植物且具有高抗菌活性的内生菌及5株潜在放线菌新种进行摇瓶发酵,发酵液的提取物用3种展层系统作薄层色谱(TLC)展层,用UV(254nm、366nm)和茴香醛试剂进行检测。实验结果表明,用1号和4号培养基发酵产生的次生代谢产物的种类最丰富,2号和3号培养基产生的较少;用II号展层系统(氯仿甲醇=41)和III号展层系统(正丁醇乙酸水=415)作TLC层析,检测到的产物最多;3种检测方法以茴香醛检测到的代谢产物最丰富。对每一株菌而言,产生最多产物的发酵培养
2、基各不相同,为了获得尽可能多的次生代谢产物,不同菌株选用的发酵培养基不一样。探究适合的发酵培养条件,为活性产物的分离、制备奠定了基础。【关键词】 植物内生菌; 发酵培养基; TLC ABSTRACT Fermentation of 89 endophytes and 5 novel species candidates of actinomycetes were carried out by four different fermentation media. Three developing systems were used for chromatography of TLC. UV 25
3、4nm, 366nm and anisaldehyde as a chromogenic agent were used for detecting compounds of these strains. Results indicate that the metabolites of these strains were the most abundant when these strains were fermented inandmedia, and only few inandMetabolites of each strain were different in different
4、media. More metabolites could be detected when the TLC was carried out in system II (chloroformmethanol=91) and system III (butanolacetic acidwater=415) with anisaldehyde test solution. These result established a base for designing of fermentation medium, isolation and purification of effective comp
5、ounds for discovery of new leader compounds from endophytes. KEY WORDS Plant endophytes; Fermentation medium; TLC 至今已描述的放线菌达40个科、180多属、4000多种1,从中发现的生物活性物质达11000种之多2,目前临床和农牧业上应用的抗生素有60%以上是放线菌生产的。当今要从普通环境微生物发现新的生物活性物质越来越困难,其中去重复就是一道难题3。但是,自然界仍然存在至少90%以上的未知微生物2,46,其中植物内生菌越来越受人们的重视7。为了充分利用云南丰富的植物内生菌资源,从
6、中发现 菌种 从云南西双版纳傣药植物分离筛选到89株抗肿瘤、抗作物病原菌的高活性内生菌菌株,其中50株放线菌、10株真菌、29株细菌;另外有5株具有抗菌活性的放线菌潜在新种,共94个菌株。 斜面培养基 真菌 PDA固体培养基8。 细菌和放线菌 酵母膏4g,葡萄糖4g,麦芽膏5g9,复合维生素,微量盐1ml/L,琼脂20g,1L水,。 复合维生素 维生素B1 1mg,维生素B6 1mg,核黄素1mg,烟酸1mg,苯丙氨酸1mg,维生素H 1mg,丙胺酸10。 微量盐 FeSO47H2O ,MnCl24H2O ,ZnSO47H2O ;水100ml。 发酵培养基 1号培养基 黄豆粉10g,甘露醇10
7、g,水1L,。 2号培养基 可溶性淀粉20g,脱脂大豆粉10g,硫代硫酸钠,FeSO47H2O ,K2HPO4 ,KCl ,水1L,。 3号培养基 葡萄糖20g,蛋白胨5g,酵母粉1g,牛肉膏,NaCl ,CaCO3 ,水1L,。 4号培养基 大豆粉30g,葡萄糖20g,淀粉5g,酵母膏2g,NaCl 4g,K2HPO4 ,MgSO47H2O ,CaCO3 2g,水1L,。 将菌种接种于斜面培养基,28培养67d,转接于4种发酵培养基,28摇床培养,放线菌发酵7d,真菌和细菌6d。 发酵样品提取物制备 发酵液加入等体积95%乙醇,28震荡4h,静置后吸取2ml上清液于试管,55蒸发乙醇后真空冷
8、冻干燥,再加入100l甲醇溶解提取物,用于高效薄层色谱(TLC)分析。 TLC分析 用毛细管点样于硅胶GF254薄层板上,用三种展层体系和三种检测条件进行分析。 三种展层体系 I:氯仿甲醇(91); II:氯仿甲醇(41); III:正丁醇乙酸水(415,用上层)。 三种检测条件 选取常用的254nm荧光淬灭成像检测、366nm荧光成像检测和具有广谱性的茴香醛硫酸溶液显色检测。茴香醛硫酸溶液(母液):乙醇冰乙酸浓硫酸(85105);100ml母液加入1ml茴香醛。 HPLC分析 甲醇溶解的样品用m孔径的滤膜过滤,10l进样于HPLC仪。色谱柱为Zorbax Eclipse XDBC18(250
9、mm,5m),波长254nm,柱温40,流速/min,流动相为甲醇和超纯水,并在40min内使甲醇比例从20%到90%线性梯度洗脱,之后在90%保持10min。 仪器与试剂 真空冷冻干燥机为英国Edwards公司产品;薄层数码成像仪为瑞士CAMAG公司Repostar 3型产品;高效液相色谱仪为美国Agilent 1100系列;薄层硅胶GF254板为青岛海洋化工厂生产。所用试剂均为分析纯。 2 结果及讨论 由于实验菌株发酵后所产生的有效成分尚不清楚,因此从菌株生长情况和产生的化合物条带的多少初步评判发酵培养基的好坏。 菌株生长情况 94株菌在4种发酵培养基中均能生长,在1号和4号培养基中的生长
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