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增强型绿色荧光蛋白
【摘要】 目的： 应用增强型绿色荧光蛋白-C1标记骨髓间充质干细胞，以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法: 在体外分离培养大鼠MMSCs，流式细胞仪检测细胞表型，以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因，荧光显微镜观察基因表达。结果: pEGFPC1在基因转染24 h后开始表达，48～72 h达高峰，12～14 d后有较多的表达。结论: 由脂质体介导的质粒pEGFPC1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。
【关键词】 骨髓间充质干细胞； 增强型绿色荧光蛋白； 基因转染
　　［Abstract］Objective: To develop an appropriate tracing method for transplanted marrow mesenchymal stem cells (MMSCs) in vivo. Methods: MMSCs of rats were isolated from bone marrow and purified by adherent culture in vitro, and the cell membrane‘s marks were detected with flow　cells were transfected with expressing plamid of pEGFPC1 mediated by lipofectamine,and transient expression was subsequently observed with fluorescent microscopy. Results: The expression of pEGFPC1 was initially found in 24h after the transfection，reached peak in 48～72 h，and remained strong express for 12～14 more days. Conclusion: Lipofectamine mediated transfection can make pEGFPC1 expressed in MMSCs safely and effectively, which shows that it is an ideal method for stem cell tracking.
　　［Key words］ marrow mesenchymal stem cells; enhanced green fluorescent protein; gene transfec- tion

　　骨髓间充质干细胞成为近年来干细胞研究的热点，其不仅本身可发挥治疗作用，同时也可作为外源基因的载体和表达场所[1]，是基因治疗理想的种子细胞。2007年3月～2008年3月通过对大鼠MMSCs体外增殖培养，应用增强型绿色荧光蛋白C1基因表达的质粒转染MMSCs并筛选培养，旨在建立一个较好的基因标记条件，为MMSCs应用于后续基因治疗的可行性奠定基础，为MMSCs的生物学行为提供新的示踪方法。
　　1 材料与方法
　　动物、试剂和仪器
　　清洁级近交系SD大鼠6只，雄性，体重(110±10)g，健康。质粒pEGFPC1由香港大学周中军教授惠赠，菌株E·ColiDH5α由贵阳医学院分子生物学实验室保存并提供，LDMEM购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，离心柱型质粒小提中量试剂盒购自TIANGEN公司，Hind Ⅲ限制性内切酶购自TakaRa公司，脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，G-418购自Solarbio公司，荧光显微镜购自Olympus公司。
　　大鼠MMSCs的体外分离、纯化、增殖培养及鉴定
　　取雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死，分离股骨及胫骨，收集骨髓腔内细胞，接种于含10％胎牛血清的L-DMEM培养瓶中，37 ℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。第3天后半量换液，以后每3 d更换新鲜完全培养液，待细胞接近90％铺满瓶底时，倾去培养液，用％胰蛋白酶常温下消化并传代，用新鲜完全培养基重悬细胞，按照1∶2接种于培养瓶中继续增殖培养。每日定时于倒置相差显微镜下观察，记录细胞形态的变化和增殖情况；取传代培养至第5代的MMSCs制成单细胞悬液，应用流式细胞仪进行细胞膜表面分子CD29、CD34、CD45及CD71的水平检测分析。
　　质粒的扩增、提取及鉴定
　　取大肠杆菌DH5α用氯化钙法制备感受态细菌，将质粒pEGFPC1转化感受态细菌，37 ℃培养24 h，挑取单菌落接种到含卡那霉素的LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养过夜，取菌液 ml，按照离心柱型质粒小提中量试剂盒说明书用碱裂解法提取质粒DNA。紫外分光光度计测定质粒DNA 浓度，取1 μg质粒DNA用Hind Ⅲ酶切，1%琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
　　质粒pEGFPC1转染大鼠MMSCs
　　应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导pEGFPC1转染MMSCs，以400 mg/L的G418进行筛选，荧光显微镜下观察细胞并拍照。为提高转染率，质粒DNA∶LipofectamineTM 2000为2 μg∶5 μl，G418的筛选浓度为400 mg/L，均为经优化后的最佳条件。
　　表达pEGFPC1基因的MMSCs的生长特性及细胞活力观察
　　在荧光显微镜和倒置相差显微镜下观察细胞生长及增殖特性。取转染质粒pEGFPC1后1～3代的传代细胞，制成单细胞悬液，以％台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共计3次，取平均值计算，细胞活力＝/总细胞数×100％。
　　2 结果
　　形态学观察及鉴定
　　大鼠MMSCs原代培养的细胞呈圆形，呈悬浮状态，第3天有部分细胞贴于培养瓶底，呈圆形或类圆形。第7～8天贴壁的细胞开始形成克隆集落，呈放射状或漩涡状生长。第14天瓶底细胞密度达90％以上，呈融合状态，由形态均一的细胞组成增殖集落。待细胞接近铺满瓶底时即可传代，第3～5代细胞已基本形成均匀一致的长梭形，排列成放射状或漩涡状，传代周期约为6～7 d。流式细胞仪检测发现，分离、纯化所得细胞表面CD29、CD71以阳性表达为主，CD45、CD34以阴性表达为主，符合MMSCs的生物学特征，见图1。
　　质粒pEGFPC1DNA的定量及鉴定
　　提取的质粒pEGFPC1，用分光光度计分别测出所提取质粒DNA溶液的A260和A280，根据公式计算出质粒DNA的纯度为～。根据公式C(mg/L)=A260×稀释倍数×50，计算出质粒DNA的浓度为180～360 mg/L。所提取的质粒DNA在出现两条较为清晰的条带，质粒DNA的酶切产物在B泳道约4 700 bp处出现一条清晰的目的条带，证实所获质粒为pEGFPC1。
　　质粒pEGFPC1转染大鼠MMSCs
　　转染质粒pEGFPC1 6 h后，MMSCs胞体内绿色荧光表达率较低，转染24 h后MMSCs中可见特异性EGFP绿色荧光，少数细胞转染后呈圆形，未能贴壁而死亡；48～72h后加入G-418进行筛选，7～8 d后空白对照组MMSCs全部死亡。转染pEGFPC1的大鼠MMSCs仍继续生长，细胞密度较低，荧光显微镜下可见到MMSCs胞体内有绿色荧光表达；12～14 d后荧光显微镜下可见到MMSCs胞体内有绿色荧光，细胞密度增高至80～90％，外形与未转染细胞相同。
　　表达pEGFPC1基因的MMSCs的生长特性及细胞活力
　　pEGFPC1在脂质体介导下转染MMSCs 后，阳性细胞发绿色荧光，呈“全细胞型”，同一时间点观察，可见处于增殖、分裂状态的各期细胞的生长和增殖不受影响。经台盼蓝染色后，表达pEGFPC1基因的第1～3代MMSCs的细胞活力大致相同，分别为96％、94％和93％，传代周期约为6 d～7 d，此时细胞呈融合状态，由形态均一的长梭形细胞组成增殖集落，排列成放射状或漩涡状。将表达pEGFPC1基因的MMSCs共传至第5代，发现仍具较强的增殖活力，未出现衰老征象。
　　3 讨论

　　应用pEGFPC1作为示踪分子时，不同的表达载体转染不同的细胞，效率不同，病毒载体转染效率较高，但有较强的免疫原性，表达质粒比病毒载体更为安全。脂质体法是近年开发的更加简便高效的方法，能被DNA的磷酸根所吸附形成DNA-脂质体复合物，同样也能被表面带负电荷的细胞膜吸附将DNA导入细胞。实验发现，质粒和脂质体浓度过低，转染效率降低；而浓度过高时，不仅转染效率降低，且容易出现细胞脱落和坏死，说明高浓度对细胞存在毒性。当脂质体-DNA复合物孵育时间过长时，可见细胞形态的变化，甚至细胞漂浮，同时转染效率也降低。因此，转染效率与质粒浓度、脂质体的浓度及脂质体-DNA复合物孵育时间密切相关。

　　在质粒的转染过程中，认为有几点值得推荐。(1)在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清培养基，因为血清会影响DNA－脂质体复合物的形成；(2)在转染培养基中不能使用双抗，即青霉素和链霉素，它们是影响转染的培养基添加物，这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞，从而降低了细胞的活性，导致转染率降低；(3)转染相同量的DNA所需的最佳阳离子脂质体的量会因细胞密度而异，质粒和脂质体浓度比例为1∶2～1∶3效果最佳。经过优化条件后发现，对MMSCs进行转染前细胞密度在80%～90%时效果较好，这样可以确保细胞未长满或未处于静止期。

　　MMSCs由于取材方便，易于分离培养，体外扩增快，具有高度自我复制的能力，而且不存在免疫排斥和病毒威胁等因素[3,4]，被认为是较为理想的基因治疗的载体[5,6]。在本实验中，将外源性基因EGFP转染大鼠MMSCs，以验证MMSCs作为基因转染载体的可行性。实验发现，采用脂质体介导EGFP瞬时转染MMSCs，转染6 h后，在MMSCs胞体内有报告基因产物的绿色荧光，此时表达率较低；转染后72 h左右对MMSCs进行加压筛选，12～14 d后可见表达EGFP的MMSCs呈融合生长，而且转染该外源基因后MMSCs生长无明显改变，依然保持自我复制的能力。

　　本实验应用的突变型EGFP基因是在水母来源的野生型GFP基因的基础上，替换了影响荧光表达效率的88个密码子中的92个碱基所构建的合成基因，由于选用了动物细胞偏爱的密码子，可以显着提高其在动物细胞中的蛋白表达量和荧光效能。EGFP是一种优化的突变型GFP，它将65位的丝氨酸用苏氨酸代替，64位的苯丙氨酸用亮氨酸代替，这种突变型EGFP基因保留了GFP作为报告基因和筛选标记的诸多优点，更易于在动物细胞中表达。这种突变体蛋白表达量的增加及有效蛋白折叠的构象变化，使突变型EGFP基因荧光强度明显增强，发射出的荧光强度比野生型GFP高35倍，大大增强了该报告分子的灵敏度，使EGFP非常适用于荧光显微镜和流式细胞术分析。因此，突变型EGFP基因比野生型GFP基因更适用于作为哺乳动物细胞的报告基因和筛选标记，可在多种异源细胞中表达[7,8]，可以广泛应用于细胞生物学、发育生物学、分子生物学、基因表达与调控、细胞分化及蛋白质的胞内定位与功能转化等诸多研究领域。
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