基因工程施工复习总结.doc

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思考题
第二章分子克隆工具酶
1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。

2.说明限制性切核酸酶命名原那么〔举例〕。

3.限制切核酸酶的星活性是指什么？
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
引起星星活性的因素:甘油浓度高〔>5%〕，酶过量〔>100U/ml〕，离子强度低〔<25 mmol/L〕，pH 值过高〔>8.0〕，或是加了有机溶剂如DMSO〔二甲基亚砜〕、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺，或是用其它2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Co2+ 或Zn2+代替了Mg2+。
4.T4 DNA ligase 和 E.coli ligase 有什么异同？

5.连接酶的反响温度如何选择，为什么？
连接酶最适的反响温度应是37℃，但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反响常采用的最正确温度一般在4-16℃间，通常多项选择用12-16℃ 30分钟到16小时。

6.什么是Klenow酶？有什么作用？
Klenow DNA聚合酶是从全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3′―5′外切活性不受影响。也称为Klenow片段〔Klenow frgment〕，或E.coli DNA聚合酶Ⅰ大片段〔E.coli DNA polymeraseⅠlarge fragment〕。
它也可以通过基因工程得到，分子量为76 kDa。由于没有5′―3′外切活性，使用围进一步扩大。
①补平3′凹端，如果使用带标记的dNTP，那么可对DNA进展末端标记。
②抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性
③通过置换反响对DNA进展末端标记
④在cDNA克隆中合成第二链
⑤随机引物标记
⑥在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA
···7.如何利用工具酶来研究某一个基因含子的存在？
···8.哪些工具酶可以用于探针标记？
T4 DNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。
反转录酶还可利用单链DNA或RNA作模板合成分子探针。
第三章分子克隆载体
1.基因工程载体应具备哪些特点？
能在宿主细胞中独立复制；
有一定的选择标记，易于识别和筛选；
有适宜的限制酶位点，可插入一段较大的外源 DNA，而不影响其本身的复制;
最好有较高的拷贝数，便于载体制备。

2.作为一个最根本的载体，它必须具备哪些功能元件？
能独立复制的单链或双链DNA;
选择标记基因；
适宜的限制酶位点。

···3.请简要描述λ噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式及其在构建载体中的作用。
4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到哪些问题？
丝状噬菌体载体的优点
a.可产生单链DNA或双链DNA，分别用于不同的目的
单链：为丝状噬菌体，可分泌到细胞外，用于测序或制备探针
双链：为含双链RF DNA存在于细菌菌落中，可供基因操作，如酶切，重组、提取、转化均应为双链DNA。具有质粒的优点
b.丝状噬菌体所能包装的DNA长度没有一定的限制，有些噬菌体颗粒可包装比野生型丝状噬菌体DNA 长7倍的DNA。
缺点
a.较大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌体扩增过程中往往不稳定，很容易发生缺失的现象，这可能是由于感染较短的噬菌体比长的噬菌体更具竞争优势所致。
b.单链载体分子感染的细胞中往往单双链混杂，纯化某种类型的分子(尤其是双链分子)比拟费力，同时由于重组 DNA容易产生缺失，培养时间不能长，故所得DNA的量有限。
c.重组中，经常出现一些能以两种可能方向插入的载体却仅以一种特定方向插入外源DNA片段的情况，这是因为外源DNA反向链的序列，在不同程度上干扰了载体基因间区域的功能所致。
克制“缺失〞的方法
a.侵染菌应防止在液体培养基中连续继代培养
b.应用贮存于-70℃，重组phage M13感染细菌后铺板，再从噬菌斑中央局部挑取细菌后进展小规模培养
c.培养时间应尽可能短(通常4-8h)
d.收获噬菌体的培养液不能再做为原液继续培养 (因在重组子和野生型噬菌体共培养中，野生型具有选择优势，几代培养后可消除重组子)。
第四章人工染色体载体
1.大容量克隆载体有哪些种类，各有何特点？

·····2.简述利用YAC克隆载体构建基因文库的原理。

·····3.简述黏粒、YAC、BAC克隆载体、P1噬菌体载体的根本构成元件。
4.黏粒载体具有哪些优缺点？怎样克制其缺点？
黏粒的优点
〔1〕同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性
〔2〕具有高容量的克隆能力
柯斯质粒的缺点
a.两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生重组，结果使克隆的外源DNA片段重排或丧失。
b.含不同重组DNA的菌落生长速度不一。当柯斯质粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主细胞作用的情况不同，结果会出现各种外源DNA 片段间的比例失调。另外不同重组柯斯质粒的产量相差悬殊。
c.包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购置包装蛋白的费用较高。
第五章表达载体
····1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？
2.简述利用T7噬菌体启动子的pET系列表达载体的工作原理。
····3.何为穿梭载体，在遗传构造上有何特点？
···4.将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？
···5.分泌表达载体需要哪些根本元件？
···6.什么是融合表达？有什么优点？
第8章 PCR技术及其应用
···1.简述PCR扩增的原理和过程？
PCR反响特点：
特异性强
灵敏度高
简便、快速
对标本的纯度要求低
PCR的根本原理是什么？用PCR扩增时，必须预先得知什么信息？
a.DNA的半保存复制原理，在体外进展DNA的变性、复性和引物延伸。
b.至少要知道足够合成一对引物的靶DNA序列。

·过程:
a.变性〔denaturation〕：将模板DNA置于92-96℃，使dsDNA在高温下解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学性质；
b.退火〔annealing〕：将温度降至37-72℃，使引物与模板的互补区相结合；
c.延伸〔extension〕：在72℃条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3‘-OH端，合成DNA。
这三个热反响过程的重复称为一个循环，经过 20-40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。
PCR引物有哪些根本要求？
在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1 μM，即1pmol/μl，在100 μl反响体系中相当于6x1013个分子。如果5%用于扩增1 kb的DNA片段，可得到3.3 μg的产物，足以用于常规分析。
引物设计要考虑的几个问题
①长度：至少16 bp，通常为18-30 bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。
②解链温度〔Tm值〕：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。
③防止引物部或引物之间存在互补序列〔3个碱基〕
④ G＋C含量尽量控制在40%-60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量防止嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3′末端的重复排列。
⑤引物的3′末端最好是G或C，但不要GC连排。
·PCR技术产生污染的主要原因和预防方法？
污染原因：1、样本间穿插污染 2、PCR试剂污染  3、PCR扩增产物污染  4、实验室中克隆质粒的污染  
预防方法：
A.防止污染：试剂小量分装，吸头及EP管一次性使用；器皿及工作区域要分开；无菌操作B、设立对照：阳性对照  阴性对照 包括：标本对照和试剂对照。
···PCR技术有哪些应用？
···2.T/A克隆的根本原理是什么？
第九章 DNA序列分析
1.简述化学降解法测序的根本原理以及主要应用围。
a.原理：将待测DNA片段的5‘端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进展化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样〔lane-by-lane〕的方式用凝胶电泳进展别离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。
b.核心原理:特定化学试剂可对不同碱基进展特异性修饰并在被修饰的碱基处〔5′或3′〕打断磷酸二酯键，从而到达识别不同碱基种类的目的。
化学降解测序法的根本步骤包括：
〔1〕对待测DNA片段的5′端磷酸基团作放射性标记；
〔2〕用化学修饰剂修饰特定碱基；
〔3〕凝胶电泳别离和放射自显影显示出各片段的长度
〔4〕读序，由于在同一反响体系中，各DNA片段的标记端一样、起始位点一样，所以，根据断裂部位至标记端起始部位之间的距离〔片段长度〕，即可得出碱基顺序。
化学降解测序法的应用
Maxam-Gilbert化学降解测序法不需要进展酶催化反响，因此不会产生由于酶催化反响而带来的误差；
a.对未经克隆的DNA片段可以直接测序。
b.化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基腺嘌呤、G＋C含量较高的DNA片段以及短链的寡核苷酸片段的序列。
c.测定长度大约250个碱基
2.简述Sanger双脱氧链终止法测序的原理。
双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3’位置的- OH缺失，致使下位核苷酸的5’磷酸基团无法与之结合。一旦双脱氧核苷酸整合到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。
···3.试述化学降解法和双脱氧链终止法的异同点。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
1.基因组DNA文库有哪些类型？其相关的特点是什么？
⑴质粒文库
质粒是最早用于构建基因组文库的载体，质粒载体所容纳的外源DNA片段一般在10 kb以。
这类基因组DNA文库一般应用于“鸟枪法〞全基因组测序研究和用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。
⑵噬菌体文库
噬菌体文库是以细菌噬菌体基因组衍生的一系列载体系统构建的，常用的有l噬菌体载体、M13单链噬菌体载体、P1噬菌体载体及由噬菌体衍生的质粒载体。
M13载体所容纳的外源片段较小，一般用于构建 cDNA文库或BAC和PAC亚克隆文库。
噬菌体文库中应用最广泛的是l噬菌体。由于其有利于利用分子杂交的方法进展筛选，用l噬菌体构建的基因组DNA文库在小基因组物种的基因克隆中起着重要作用。
⑶黏粒文库
黏粒又称柯斯质粒，是由l噬菌体的cos序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因构建而成的一类特殊的质粒载体。
黏粒载体和噬菌体载体类似，主要用于构建小基因组物种的基因组DNA文库。
利用它们在筛选上的优势来别离单个基因或构建一定区间围的亚基因组DNA文库等。
⑷人工染色体文库
包括酵母人工染色体文库、细菌人工染色体文库和P1人工染色体文库，也称为大片段基因组DNA文库，容纳的外源DNA片段为100 kb-1 Mb。
主要用于大基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组测序等，在基因组研究中应用越来越广泛。
⑸亚基因组文库
亚基因组文库是相对于基因组文库提出的，文库的对象不是全基因组围，而是基因组的某一区段，如基因组DNA某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段〔如一个YAC或BAC克隆等〕。
···2.构建大片段基因组文库过程中需要注意哪些问题？
3.均一化cDNA文库构建的根本原理是什么？
mRNA-cDNA杂交方法的原理是用过量的驱动mRNA 与供体的cDNA文库质粒反复多轮杂交，去除驱动和供体共同表达的基因，构建均一化的、扣除杂交cDNA文库。
4.扣除cDNA的根本原理是什么？
扣除杂交技术〔subtractive hybridization〕
将含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为待测样本〔tester〕，将基因表达谱相似或相近但不含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为对照样本〔driver〕。将tester和driver的cDNA进展屡次杂交，去掉在二者之间都表达的基因，而保存两者之间差异表达的基因，使低丰度基因在文库中的比例大大提高，筛选到差异表达的基因的可能性也大大提高。
···5.全长cDNA文库构建的原理？
6.酵母双杂交的根本原理？
酵母双杂交系统简称双杂交系统〔two-hybrid system〕，也叫相互作用陷阱〔interaction trap〕，是根据真核生物转录调控的特点创立的一种体鉴定基因的方法。其筛选的基因不是探针的直接编码物，而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因，即筛选与基因的产物发生相互作用的蛋白的编码基因。
·酵母双杂交系统的根本原理
来自酵母转录激活因子〔transcriptional activator〕GAL4是一种典型的转录因子，有两个功能域:
一是DNA结合构造域〔DNA binding domain, BD〕
靠近羧基端,含有几个锌指构造，可与DNA序列中半乳糖苷酶的上游激活序列〔upstream activating sequence, UAS〕结合；
二是转录激活构造域〔activation domain, AD〕,
可与RNA聚合酶或转录因子TFII相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。这两个构造域的功能是独立的。
酵母双杂交系统利用融合蛋白的策略，将要筛选的“探针〞蛋白X与BD融合为BD-X〔通常称为诱饵， bait〕；
将所要筛选的对象Y与AD构建成融合蛋白的AD-Y cDNA文库〔即将目的cDNA与AD基因构建融合基因文库〕，通常称AD-Y为猎物〔prey〕；
将它们导入酵母细胞中共表达，如果X与Y相互作用，那么会导致BD和AD在空间上接近形成一个有功能的转录激活因子，激活下游报告基因的表达。
第十三章植物基因工程
1.植物基因转化受体系统具备的条件？
a.高效稳定的再生能力
b.较高的遗传稳定性
c.具有稳定的外植体来源
d.对选择抗生素敏感
e.对农杆菌有敏感性
f.是否具有经济价值或有潜在的生产应用价值

2.植物基因工程常用的受体系统有哪些？
a.愈伤组织再生系统
b.直接分化再生系统
c.原生质体再生系统
d.生殖细胞受体系统

3.植物基因转化方法有哪些？
a.原生质体介导法
包括：
PEG介导的基因转化
脂质体介导基因转化
电激法介导基因转化
显微注射介导的基因转化
激光微束介导的基因转化
b.基因枪法
c.根癌农杆菌介导法
···4.农杆菌转化的根本原理？
5.什么是二元载体？和一元载体比有什么优点？
二元载体(binary vector)系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变质粒构成的双质粒系统
因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故称之为反式载体(trans vector)。
二元载体较一元载体有更多的优点：
a.首先，二元载体的构建较为方便；而一元载体还需在根癌农杆菌中进展共整合，构建效率相对较低。
b.其次，二元载体的外源基因的转化效率要高于一元载体。
所以目前在植物基因工程研究中主要使用二元载体系统。

6.植物转化常用的选择基因和报告基因有哪些？报告基因有什么特点？
植物基因工程中的选择标记基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。
选择基因:与外界存在的筛选压力如抗生素等相互作用，以筛选出被转化的细胞；
最常用的有新霉素抗性基因〔neor〕、庆大霉素抗性基因〔gentr〕、潮霉素磷酸转移酶〔HPT〕基因〔hpt〕，以及膦丝菌素乙酰转移酶基因〔bar〕等。

报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否成功地导入受体细胞〔器官或组织〕，是否启动表达的一类特殊用途的基因。
提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段，它的应用不依赖于外界选择压力的存在。
理想的报告基因具备的根本要求
①报告分子不存在于宿主中或易于与源性基因相区别；
②应有一个简单、快捷、灵敏及经济的分析方法；
③报告基因的分析结果应具有很强的线性围，便于分析启动子活性的大小变化；
④报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物体生理活动。
最常用的报告基因
β-葡萄糖甘酸酶基因〔gus〕
氯霉素乙酰转移酶基因〔cat〕
荧光素酶基因〔luc
绿色荧光蛋白〔GFP〕基因〔gfp〕等。

7.转基因植株的鉴定方法有哪些，作为一组完整的转基因植株鉴定数据至少应包含哪些参数？
a.PCR检测外源基因的整合
b.Southern 杂交检测外源基因的整合
c.RT-PCR 检测外源基因的表达
d.Northern杂交检测外源基因的表达
e.Western杂交检测外源基因表达的产物

第十四章动物基因工程
···1.简述反转录病毒在动物基因工程中的作用。
2.试述基因敲除与基因敲入的区别。
3.质粒载体与病毒载体有何异同？
表达载体:
(1)带有原核复制区
(2)带有选择性标记基因
保证重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增
(3)必须包括能在真核细胞表达的相关组件
一般包括转录外源DNA序列的启动子元件、转录产物有效地加上poly(A)尾巴所必需的信号序列、真核细胞中的选择性标记，以及一些附加元件，如增强子、含子、剪接供体与受体点，以保证外源基因的高效表达。
·病毒载体：
①携带外源基因并能包装成病毒颗粒；
②介导外源基因的转移与表达；
③对机体不致病。

4.简述转基因小鼠的制备过程。
·DNA显微注射法制备转基因小鼠
·胚胎干细胞法制备转基因小鼠

DNA显微注射法制备转基因小鼠
⑴超数排卵
对年轻、安康未孕母鼠〔4-5周龄〕注射促性腺激素，诱导超数排卵，与种公鼠合笼交配。从输卵管的壶腹部收集原核期受精卵，排卵率一般可达30枚以上，但具体排卵多少受激素种类和小鼠品种影响较大。
⑵基因准备
从整合率上看线形DNA分子要好于环形DNA，而环形DNA在细胞的半衰期较长，适用于瞬间表达与基因治疗。
尽管载体DNA序列不影响外源DNA的整合效率，但载体序列能抑制转基因的表达，因此应尽量去除转基因构造中的载体局部。
⑶显微注射
(1)外源DNA进入原核
(2)培养液中培养
(3)进展冷冻保存，或直接用于移植，或继续培养发育到囊胚后再移植。

⑷胚胎移植
胚胎:囊胚期或囊胚期之前的胚胎，可依据早期胚胎的发育阶段和物种的不同决定移植的部位。
注射后的单细胞至桑葚期的胚胎应移植到0.5d
假孕鼠的输卵管，而到达囊胚期的胚胎那么须转移至2.5 d假孕鼠子宫。
未经注射的新鲜胚胎的移植成功率为50%-70%，注射胚胎移植后的受胎率有所下降，仅为10%-30%。
⑸转基因个体鉴定
承受胚胎移植的假孕鼠产下的幼鼠是否含有外源基因？
〔1〕分子鉴定，判定其基因组是否整合了外源基因
〔2〕目的蛋白表达与否和表达水平测定
〔3〕产物的别离纯化及生物活性检测

2．胚胎干细胞法制备转基因小鼠
胚胎干细胞〔embryonic stem cells， ESCs〕: 从早期胚胎细胞团〔inner cell
mass, ICM〕中别离出的未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性的细胞。
当将胚胎干细胞人工注入宿主早期胚胎的囊胚腔〔又称细胞团注射〕后，所注入的胚胎干细胞可以同宿主细胞团细胞共同发育，分化成成体动物的各种组织〔包括生殖细胞〕，形成嵌合体。
a.转基因胚胎干细胞的获得
b.囊胚注射
c.嵌合体的检测和育种

5.转基因动物的鉴定方法有哪些？
a.标记筛选法利用正负筛选标记
b.分子鉴定法：PCR扩增、斑点杂交、Southern杂交、荧光原位杂交
c.表达水平检测：报告基因检测、 Northern杂交、 RT-PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 Western杂交、目的蛋白的生物活性检测
判定是否产生出转基因动物的重要标准是检查外源基因是否整合到动物的生殖系统中，即是否能够稳定遗传。

第十五章酵母基因工程
2.作为一个酵母表达载体，包括那些根本元件？
典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒。
·原核局部：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。
·酵母局部：维持复制的元件，如附加型的2μm质粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列〔auto-replication sequence, ARS〕，或整合型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。
·分泌型表达载体还要带有信号肽序列
酵母表达载体主要元件
①启动子
最常用的启动子是基因AOX1的启动子，在它控制下的外源基因在甲醇诱导时能得到高效表达。
PGAP〔三磷酸甘油醛脱氢酶启动子〕：在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子，在它控制下的β-LacZ 基因表达率比甲醇诱导下的以PAOX1启动的产量更高。
PGAP不需要甲醇诱导，发酵工艺更为简单，又因其产量很高，所以成为代替PAOX1的最具潜力的启动子。
②选择标记
常用HIS4，以及ARG4、TRP1或URA3作选择标记的载体。
巴斯德毕赤酵母不能利用蔗糖，所以可用来源于酿酒酵母的蔗糖酶基因SUC2作为选择标记。
抗性选择标记有抗生素G418抗性基因和Zeocin 抗性基因〔一种强诱变剂〕。
leu-作为酵母载体的选择标记基因
③信号肽序列
表达外源蛋白分胞表达和分泌表达。
毕赤酵母本身根本不分泌源蛋白，所以外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
如果自身信号肽序列效果不佳，可用α-交配因子引导序列引导外源蛋白的分泌。在巴斯德毕赤酵母载体中还使用过蔗糖酶基因 SUC2的信号肽序列、酸性磷酸酶基因PHO1的信号肽序列等。
···3.表达附加型表达载体和整合型表达载体用在表达外源基因上的区别。
···4.如何提高基因在染色体上的拷贝数来提高异源基因的表达量？

附
什么是蓝白斑筛选法？ 
答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β-半乳糖苷酶〔lac〕的基因片段，携带有lac基因片段的载体转入lac-宿主菌后，在含有X-gal平板上形成浅蓝色的菌落或噬菌斑。外源基因插入lac〔或lac基因局部被取代〕后，重组的菌体或噬菌斑将丧失分解的能力，转入lac-宿主菌，在含有X-gal平板上形成白色的菌落或噬菌斑，非重组的菌落或噬菌斑那么为蓝色。

- . 可修编.