CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导的哮喘小鼠气道炎症的影响.docx
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1、CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导的哮喘小鼠气道炎症的影响【摘要】 目的: 观察CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导哮喘小鼠气道炎症的影响. 方法: Balb/c小鼠50只,随机分成5组: 磷酸盐缓冲液对照组;卵白蛋白组;OVA/RSV模型组;CD8mAb治疗组;IgG2mAb治疗对照组. 应用OVA腹腔注射致敏、OVA气道雾化结合RSV滴鼻激发复制小鼠哮喘模型,观察实验动物气道炎症和气道反应性变化,支气管肺泡灌洗液作细胞分类计数,测定BALF上清中白细胞介素4, IL5, 干扰素含量并采用三色光流式细胞分析法检测气管旁淋巴结中CD4+, CD8+T细胞及细胞内细胞因子IFN, IL4, IL5表达
2、. 结果: 与模型组相比,CD8mAb可明显减轻小鼠气道炎症和气道高反应. CD8mAb治疗后BALF中嗜酸性粒细胞及上清中细胞因子IFN, IL4, IL5含量明显减少,CD8+T细胞百分比及Tc2/Tc1比值明显下降. PBLN中CD8+T细胞百分比与BALF中IFN, IL4, IL5含量呈显着正相关(分别rs=, ; rs=, ; rs=, ). 结论: CD8mAb对RSV诱导的哮喘小鼠气道炎症和气道高反应具有抑制作用,其部分机制可能与致敏条件下病毒感染引起CD8+T细胞功能发生转化,即由产生IFN为特征的细胞毒CD8+T细胞转化为产生IL4, IL5为特征的非细胞毒CD8+T细胞有
3、关. 【关键词】 呼吸道合胞病毒;哮喘;CD8+T细胞;CD8单克隆抗体;气道炎症 0引言 临床及流行病学研究表明,呼吸道病毒感染是哮喘急性加重、致死的重要原因1. Osullivan等2在因重度哮喘死亡患者的肺标本中检测到呼吸道合胞病毒,鼻病毒基因组,并发现气管旁有大量CD8+T细胞浸润,且CD8+T细胞表面分子CD25,穿孔素表达增高,提示重度哮喘患者气道局部存在CD8+T细胞数量和功能的异常. Schwarze等3的研究表明,病毒诱导的哮喘与过敏性哮喘在气道炎症的发生机制上有所不同,前者的Th2型炎症主要由CD8+T细胞产生和维持,而后者主要由CD4+T细胞产生和维持. 上述研究提示,C
4、D8+T细胞在呼吸道病毒诱导的哮喘发作及急性加重中起重要作用. 因此,我们采用RSV诱导的小鼠哮喘模型,观察CD8mAb对哮喘气道炎症和气道反应性的影响. 1材料和方法 材料 动物、试剂和仪器清洁级雌性Balb/c小鼠50只,68周龄,体质量1720 g. 乙酰胆碱,卵白蛋白; IFN, IL4, IL5酶联免疫吸附试验试剂Kit; 大鼠抗小鼠CD8a(Ly2) mAb,大鼠抗小鼠IgG2mAb对照抗体;流式细胞检测试剂盒包括:刺激剂卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯,离子霉素, 阻断剂(brefeldinA,BFA),大鼠抗小鼠PECy5标记CD3, FITC标记CD8,PE标记IFN, IL4, IL5
5、 mAb及大鼠IgG1阴性对照(Caltag);动物肺功能体描箱,呼吸机(北京鑫奥成科技有限公司提供);软件分析系统,酶标仪,真空冻干机,FACScalibur流式细胞仪. 细胞和病毒RSV Long株A型;人喉癌上皮细胞. HEp2细胞在含100 mL/L灭活胎牛血清的DMEM中37, 50 mL/L CO2条件下培养,细胞长满单层后,RSV接种HEp2细胞,继续在含20 mL/L灭活胎牛血清的DMEM的维持液中培养,待细胞病变达100%时收获病毒,并冻存于-80冰箱中,反复冻融、离心后,留上清备用. 参照文献4的方法采用空斑形成试验测定病毒滴度,取滴度为106空斑形成单位RSV备用. 方法
6、 实验分组和动物模型 Balb/c小鼠50只随机分成5组,每组10只,分别为磷酸盐缓冲液对照组;卵白蛋白(OVA)组;OVA/RSV模型组;CD8mAb治疗组;IgG2mAb治疗对照组. 动物分别于第1,14日腹腔注射致敏液 mL,第15日起将小鼠置于透明密闭容器中以10 g/L OVA溶液10 mL雾化吸入,每次20 min,隔日1次,连续5 wk,并分别于第21, 35, 49日用滴度为106 PFu/mL的RSV 50 L鼻腔滴入,每日观察小鼠症状,于最后1次RSV滴入4 d后测气道反应性. CD8mAb治疗组和IgG2mAb治疗对照组分别于RSV应用6 h后按1 mg/kg ip CD
7、8mAb和IgG2mAb对照抗体. 气道反应性测定小鼠经腹腔麻醉、气管切开后,置密闭体描箱中,吸气管、呼气管、测压管按指示连接,小鼠按频率90次/min、潮气量56 mL/kg机械通气,调节呼气末压为-8 cmH2O,记录经肺压、流速、潮气容积变化. 气道反应性用ACH激发后以肺阻力(RL)表示,将ACH分别按浓度、容积为35 L/次尾静脉注射激发,经肺压和潮气容积曲线回到基线后,将浓度增加3倍,每次应用ACH后记录至少10次峰反应的肺变量. 肺泡灌洗液( BALF)细胞分类计数以 mL PBS进行肺泡灌洗,反复2次,1200 r/min离心5 min,上清保存在-20冰箱中待测定细胞因子.
8、沉淀细胞用 mLHanks液重悬,取 mL进行细胞计数,其余沉淀细胞经涂片,瑞氏吉姆莎染色,按细胞形态进行分类计数(至少计数200个细胞). 细胞因子测定将BALF上清放入真空冻干机内-70冻干后,加入200 L生理盐水重融,按ELISA试剂说明书检测其中IFN, IL14, IL5含量. 三色光流式细胞分析取气管旁淋巴结(PBLN)34枚,眼科剪仔细剪碎,经300目尼龙膜过筛获单细胞悬液,1200 r/min离心5 min, 将沉淀细胞置于RPMI1640培养液中,调整细胞密度为105/L,按参考文献5的方法进行流式细胞检测. 肺组织病理学变化取右肺中叶进行乙醇脱水,石蜡包埋连续切片,常规苏
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