Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究.docx
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1、Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究【摘要】 为了研究velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡效应及机制,采用台盼蓝拒染法检测2、10、50和100 nmol/L velcade处理U266细胞活率,用流式细胞术分析Annexin-V、线粒体跨膜电位(m)和氧自由基,用半定量RT-PCR法检测bcl-2 mRNA的表达。结果表明:velcade抑制U266细胞增殖;诱导U266细胞凋亡,24小时Annexin-V阳性细胞比例增高,M降低;12小时时活性氧明显增高,荧光强度增强; 抗凋亡基因bcl-2表达降低。结论:velcade对U266细胞具有增殖抑制和杀伤作
2、用,其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导U266细胞凋亡。【关键词】 velcade; 多发性骨髓瘤; 细胞凋亡Multiple Myeloma Cell Line U266 Apoptosis Induced by VelcadeAbstract To investigate the effect of velcade on multiple myeloma cell line U266 apoptosis and its mechanism,cell viability was estimated by trypan blue dye exclusion. Annexin-V,mitocho
3、ndrial transmembrane potential (m) and reactive oxygen species (ROS) labeled by DCFHDA were examined by flow cytometry,the expression of bcl-2 mRNA was detected by semi-quatitative RT-PCR. The results showed that the velcade inhibited the growth of U266 cells and reduced cell viability accompanied b
4、y appearance of morphologic characteristics of apoptosis. Velcade at 50 nmol/L increased Annexin V positivity and fluorescence intensity of DCF because of ROS generation while it decreased the m of U266 cells. Expression of anti-apoptotic gene bcl-2 mRNA also decreased. It is concluded that velcade
5、inhibite the growth and reduce cell viability of U266 cells. Velcade can induce U266 cells apoptosis by intrinsic cell apoptotic pathway.Key words velcade; multiple myeloma; apoptosis 多发性骨髓瘤是一种浆细胞克隆性增生的血液系统恶性肿瘤,多发生于老年人。随着社会人口的老龄化,其发病率呈逐渐增高的趋势。几十年来对MM一直采用激素和细胞毒性药物联合治疗,尽管近年来加用反应停抑制血管新生治疗或采用自体骨髓移植治疗,但其
6、仍是一种不可治愈的血液系统肿瘤。由此可见,开发新的治疗方法有重要的临床价值。蛋白酶体抑制剂近年来作为MM新的治疗制剂用于临床试验,本研究就临床新药蛋白酶体抑制剂velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞的凋亡作用进行探讨。 材料和方法细胞培养U266细胞置于含10%的热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液 中,于37、5% CO2和95%空气湿度条件下进行培养。实验过程中,细胞以105 细胞/毫升的密度接种培养,并与不同浓度velcade一起进行孵育,对照加DMSO。细胞活率由台盼蓝拒染法检测,根据处理组存活细胞数与死细胞数的比例来计算。形态学观察,细胞用cytospin (Shand
7、on,Runcorn,UK)收集至载玻片,用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。每次试验重复3次。生长抑制率及细胞活率按如下公式计算 生长抑制率 (对照组细胞数-处理组细胞数)对照组细胞数100%存活率活细胞数(活细胞数死细胞数)100% Annexin-V、线粒体跨膜电位(m)和氧自由基的流式细胞仪分析Annexin-V 分析使用FITC标记的Annexin V和PI双染法检测细胞凋亡,根据 Becton Dickinson Biosciences 公司提供的说明书进行操作。简单地说,取105 细胞,经PBS 漂洗后加100 l 结合缓冲液,重悬细胞,加5 l AnnexinV-FITC,1
8、0l PI 避光孵育15 分钟后加400 l 结合缓冲液,用流式细胞仪检测。线粒体跨膜电位(m)检测取5105细胞,用PBS清洗1次,加入10 g/ml Rh12337孵育30分钟,用PBS漂洗1次,加入终浓度10 g/ml PI 4暗处放置30分钟,用流式细胞仪检测。活性氧测定 细胞内活性氧测定方法参照文献1方法进行,DCFHDA (Sigma公司产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH,在活性氧存在下被氧化成DCF,DCF 荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。DCF 的激发波长为485 nm,吸收波长为530 nm。将药物处理的细胞经过PBS洗涤,重悬于1 ml含有10 mol/L D
9、CFHDA的PBS中,以未加染料的样品作为对照,37孵育20分钟,以PBS洗涤2次,用流式细胞仪检测5 000个活细胞的荧光强度。velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266 bcl-2 mRNA表达的半定量RT-PCR检测细胞总RNA抽提 收集3106细胞,用TRIzoL试剂按说明书抽提细胞总RNA。cDNA 合成及PCR 扩增 方法参见文献 2 ,PCR引物:GAPDH:有义链5-GAAGGTGAAGGT CGGAGTCA-3;反义链5-GAAGATGGTGATGG GATTTC-3。bcl-2: 有义链5 -ACTTGTGGCCCA GATAGG-3,反义链为5-CGACTTCGCCGA
10、GAT GTC-3。PCR 产物用6 %聚丙烯酰胺凝胶电泳分析照相,在双波长色谱扫描仪上扫描电泳带。GAPDH片段长度216 bp,bcl-2片段389 bp。结 果velcade对U266细胞增殖抑制和杀伤作用研究结果表明,velcade可以抑制U266细胞的生长,同时伴有细胞活率的降低。U266细胞经2、10、50和100 nmol/L浓度velcade 24小时处理后生长抑制率的3次均值分别为、和,48小时时分别为、%、和;在0、2、10、50和100 nmol/L浓度时24小时活率分别为、和,48小时时分别为、和%。根据活率48小时时下降70-80选择药物浓度,因此选择velcade
11、50 nmol/L作为药物处理浓度。velcade对U266细胞凋亡作用50 nmol/L velcade处理的U266细胞呈现出细胞形态学改变,表现为染色体凝聚、细胞核破裂而细胞膜保持完整及出现多个凋亡小体等。24小时Annexin V-FITC/PI 双标结果显示,凋亡细胞比例重复3次的均值为,明显高于未用velcade处理对照组的%。线粒体跨膜电位检测显示M降低,Rh123阳性细胞比率重复3次的均值为%,对照为%。活性氧检测我们采用DCFHDA检测velcade处理的U266细胞活性氧及平均荧光强度。结果发现,在12小时时活性氧明显增高,平均荧光强度显着增高,由对照的增强到,流式细胞仪直
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