人脑胶质瘤骨桥蛋白的表达.docx
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1、人脑胶质瘤骨桥蛋白的表达【摘要】 目的:探讨骨桥蛋白在人脑胶质瘤中的作用、表达及其意义. 方法: 采用RTPCR及免疫组化染色方法检测脑胶质瘤组织和正常组织中骨桥蛋白. 结果: 骨桥蛋白在胶质瘤组织细胞中表达,而在正常脑组织细胞中无表达,而且OPN的表达浓度与胶质瘤恶性程度呈正相关. 结论: 人脑胶质瘤中OPN的表达与其恶性程度密切相关.【关键词】 神经胶质瘤;骨桥蛋白;免疫组织化学0引言人脑胶质瘤侵袭性生长是术后复发和临床疗效差的主要原因,过程涉及到细胞信号传导、细胞黏附、细胞迁移等多个环节. 骨桥蛋白是一种含有整合素结合序列GRGDS的分泌型磷酸化酸性糖蛋白,它对于OPN的黏附功能起重要作
2、用. 整合素是OPN的受体,OPN通过细胞黏附序列GRGDS识别整合素与细胞结合,刺激了细胞信号的传送途径,促进了细胞的黏附与迁移,促使了细胞向恶性发展1-3,我们采用免疫组化和RTPCR方法,探讨OPN在脑胶质瘤中的表达.1材料和方法1材料河南省人民医院200308/200502手术切除胶质瘤转移和正常脑组织标本共36例. 按WHO病理分级将胶质瘤分为级,其中级6例,级7例,级6例,级4例,转移癌8例,正常脑组织5例. 2方法免疫组化染色采用SP染色三步法. SP试剂盒购于美国ZYMED生物技术公司. 按操作说明进行各组的OPN免疫组化染色. 简要步骤: 30 mL/L过氧化氢室温孵育,DH
3、2O冲洗,PBS浸泡,100 mL/L山羊血清封闭;滴加适当比例稀释的一抗工作液,PBS冲洗;滴加生物素标记二抗,PBS冲洗;滴加辣根过氧化物酶标记物,显色剂(DAB)显色. 阳性对照用已知OPN表达阳性的组织切片,阴性对照用PBS代替一抗,以胞浆/胞膜内出现棕黄色或棕色颗粒为阳性细胞.总RNA的提取和RTPCR 每 g组织中加入1 mL Trizol,提取总RNA并按说明书操作. 逆转录反应: 总RNA 4 g,g/L oligo(Dt) 1 L,加入一定量DPEC处理水,使总体积少于15 L,放70 5 min. 将反应体系立即置冰上,再加入5 mmol/L Buffer 6 L,10 m
4、mol/L dNTP 1 L,kat/L RNAsinL,mkat/L MMLV 1 L,用DPEC处理水定容于30 L. 37 1 h, 94 5 min. PCR: 将逆转录产物进行扩增. 引物是自行设计并由上海生物有限公司合成. OPN上游引物序列为5CTGATGCTACAGACGAGGAC 3(668687);下游引物序列为5ACTATCAATCACATCGGAAT 3;内参照G3PDH上游引物序列为5GGTCGGAGTCAACGGATTGGTCG 3(90113);下游引物序列为5CCTCCGACGCCTGCTTCACCA 3 (877856). 50 L的反应体系中加入10 mmo
5、l/L buffer 2L, 25 mmol/L MgCl2 10 mmol/L dNTP 1 L,G3PDH引物各1 L, OPN引物各1 L,kat/L Taq酶 L,反转录产物5 L,加DEPC处理水至50 L. 94 5 min预变性,94 30 s55 1 min72 80 s,共30个循环,72 10 min,4冷却后-20保存. 电泳及定量分析:PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果,凝胶成像系统分析灰度值,结果为OPN灰度值/G3PDH灰度值.统计学处理: 各组织相对积分值以xs表示,采用统计软件进行数据处理,组间差异比较采用非参数秩和检验.2结果在正常脑组织
6、中(Fig 1)未见棕黄色或棕色阳性颗粒,即没有表达OPN,而在胶质瘤组织(Fig 2)细胞膜和细胞质中以及血管内皮细胞均见棕黄色或棕色阳性颗粒,即表达OPN. 且IV级胶质瘤组织中OPN的表达要比II级胶质瘤组织中表达明显增加.表1RTPCR检测OPN mRNA在正常人脑组织和人脑胶质瘤组织中的表达量3讨论OPN是一种细胞分泌性蛋白,富含甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸残基的磷酸化酸性糖蛋白2,它首先由骨骼中分离出,在人体免疫调节、细胞信号传导、炎症反应、癌肿的转移中起重要作用,通过其受体融合素及CD44等促进细胞趋化、黏附、迁移并刺激细胞信号的传送途径4-6,从而促进了细胞的恶性发展. 免
7、疫组化结果检测发现恶性星形细胞瘤表达OPN的量较高,而良性星形细胞瘤与非肿瘤组织表达OPN的量较低,这些结果也表明胶质瘤细胞能表达OPN,且表达程度与它的恶性程度相关1,而与癌细胞的转移有关的是OPN中的GRGDS序列通过其受体整合素与细胞结合完成对细胞的黏附与迁移作用. Takano等7认为OPN与血管生成有关,可介导OPNmRNA在血管内皮中的表达.本结果说明,OPN和胶质瘤恶性程度之间及胶质瘤与正常脑组织间存在内在联系,统计学上呈明显的正相关性. 有学者认为,OPN在启动巨噬细胞介导的细胞素Th1、抑制素Th2的延迟性超敏反应中起重要作用,肿瘤的生长常常因为机制缺乏正常的免疫识别能力和抵
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