吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用与PTEN表达的关系.docx
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1、吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用与PTEN表达的关系【摘要】 目的 观察表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对人结肠癌细胞的生长抑制作用,探讨这种作用与结肠癌细胞PTEN表达的关系。方法 应用体外药物敏感实验检测吉非替尼对6种人结肠癌细胞系的生长抑制作用;应用RT-PCR检测不同结肠癌细胞中PTEN mRNA水平;应用Western blot检测结肠癌细胞中PTEN蛋白表达水平。结果 吉非替尼在体外对6种结肠癌细胞系的生长抑制作用差异很大。吉非替尼作用浓度为1 mol/L时,Lovo细胞系抑制率达34%,对吉非替尼最为敏感, 其半量抑制浓度10 mol/L; HT29和SW480为中度敏
2、感;而HCT116、LS174T和SW620不敏感,其IC50100 mol/L。各个细胞系中PTEN mRNA和PTEN蛋白均有表达。结论 吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用与PTEN mRNA和PTEN蛋白表达水平无明显相关,即PTEN表达状态还不能作为预测结肠癌对吉非替尼敏感性的可靠生物学指标。【关键词】 结肠肿瘤; 细胞系; PTEN; 吉非替尼; 生长抑制Relationship between PTEN expressions and inhibitory effects of Gefitinib on the growth of colon cancer cells 【Abstr
3、act】 Objective To observe the inhibitory effect of Gefitinib, a selective oral epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, on the growth of human colon cancer cells, and investigate the relationship between the sensitivity of colon cancer cells to Gefitinib and PTEN expressions. Meth
4、ods The inhibitory effects of Gefitinib on 6 kinds of colon cancer cells , the levels of PTEN mRNA in different colon cancer cells, and PTEN protein expressions in colon cancer cells were detected by MTT assay, RT-PCR and Western blot, respectively. Results The inhibitory effects of Gefitinib on the
5、 6 colon cancer cells in vitro varied a lot. When the concentration of Gefitinib was 1 mol/L, Lovo cells had the most sensitivity to Gefitinib with an IC5010 mol/L; HT29 and SW480 had moderate sensitivity, and the IC50 ranged from 10 mol/L to 100 mol/L; HCT116, LS174T and SW620 were insensitive to G
6、efitinib, and their IC50100 mol/L. All the colon cancer cell lines exhibited PTEN mRNA and protein expressions. Conclusions PTEN mRNA and protein expressions might not be associated with the inhibitory effects of Gefitinib on the growth of colon cancer cells. The expression of PTEN can not be taken
7、as the indication of the sensitivity of colon cancer cells to Gefitinib. 【Key words】 Colon cancer; Cell line; PTEN; Gefitinib; Growth inhibition 吉非替尼是目前备受关注的靶向治疗药物,是一种具有口服活性的选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂,能阻断EGFR激活的多条信号通路。吉非替尼对不同的结肠癌细胞系均表现出不同程度的抗肿瘤活性1-2。PTEN是一种具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,当PTEN功能减弱或缺失,可引起EGFR下游通路中的Akt过度活化
8、,降低细胞对凋亡的敏感性。本文将探讨结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性与PTEN表达的关系。 1 材料与方法细胞系培养 人结肠癌细胞系Lovo、HCT116、HT29为本室传代保存,LS174T、SW480、SW620购自中国科学院上海细胞生物学研究所。SW620用Leibovitz L-15培养液,其余以DMEM高糖培养液培养,其中含10%胎牛血清,各100 U/ml的青霉素、链霉素,用%胰酶消化传代。取对数生长期的细胞用于各项实验。 药物和主要试剂 吉非替尼溶解于二甲基亚砜中,储存浓度为200 mmol/L,-20 保存,仅在每次实验前用新鲜培养液稀释至所需浓度,作用于细胞的DMSO浓度不超过%
9、。 二甲基四氮唑蓝、DMSO等购自美国Sigma公司;Tripure为瑞士Roche公司产品;M-MLV逆转录酶为美国Promega公司产品;混合Taq酶为北京天为时代科技有限公司产品;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;抗PTEN抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;内参-肌动蛋白抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司;化学发光试剂盒购自美国Pierce Biotechnology公司。 体外药物敏感实验 调整细胞浓度后取100 l以每孔含细胞数5000个接种于96孔培养板中,37 孵育24 h后,每孔加入含不同药物浓度的完全培
10、养液100 l,对照组不含药物只加入等量的DMSO,每组设4个复孔,继续孵育72 h。每孔加20 l二甲基四氮唑蓝液,培养4 h后小心吸去培养液,每孔加入200 lDMSO。用Model 550型酶标仪在490 nm下测吸光值,计算药物的细胞生长抑制率:抑制率100%,并求出半量抑制浓度,每个实验重复3次。 RT-PCR检测 按Tripure试剂说明提取细胞总RNA,取2 g RNA合成cDNA。根据Gene Bank提供的PTEN mRNA序列设计合成引物。上游引物:5-GGTTCACATCCTACCCCTTTG-3,下游引物:5-CATTCTTTGTTGA-TAGCCTCCA-3,产物长度
11、453 bp。PCR反应条件:94 预变性2 min; 94 30 s, 56 30 s, 72 90 s,35个循环;72 延伸10 min。PCR产物用%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以磷酸甘油醛脱氢酶为内参照,产物长度715 bp。 Western blot检测 以RIPA细胞裂解液提取各种细胞总蛋白。以Bradford法测定蛋白浓度。取各组50 g蛋白上样,经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电转移至PVDF膜。抗PTEN一抗4 孵育过夜。HRP标记的二抗室温孵育1 h,避光显影检测杂交信号。 统计学分析 数据用xs表示,应用SPSS 软件进行单因素方差分析。为差异有统计学意义。 2
12、 结果结肠癌细胞系对吉非替尼的敏感性 吉非替尼在体外对6种结肠癌细胞系的生长抑制作用差异很大。在吉非替尼作用浓度为1mol/L时,Lovo结肠癌细胞系的抑制率已达34%, 结肠癌细胞系PTEN mRNA表达 RT-PCR结果显示, Lovo、 HCT116、 HT29、LS174T、SW480和SW620结肠癌细胞系均不同程度表达PTEN mRNA。其灰度值依次为,其中LS174T表达最强,其他细胞系间无差异。 结肠癌细胞系PTEN蛋白表达 Western blot检测结果可见, Lovo、 HCT116、HT29、LS174T、SW480和SW620结肠癌细胞系的PTEN蛋白均有表达,但表达
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