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海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用的实验研究
【摘要】 目的研究海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用，并对其机制进行初探。方法观察Fucoidan对小鼠S180移植性实体瘤、体外培养肿瘤细胞的作用，并了解其对动物免疫功能的影响。结果Fucoidan能明显抑制小鼠S180实体瘤的生长，且呈现剂量相关性，其抑瘤率达到环磷酰胺阳性对照的%～％，对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的生长均无显着抑制作用，Fucoidan中剂量组和大剂量组能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数α和脾脏器指数，但对胸腺脏器指数影响不大。在DNFB诱导迟发性变态反应实验中，Fucoidan中剂量组和大剂量组亦可使小鼠耳肿胀度增大。结论Fucoidan具有抗肿瘤作用，其机制可能是通过对免疫功能的增强来实现的。
【关键词】 海藻提取物褐海藻多糖硫酸酯；抗肿瘤
　　Abstract：ObjectiveTo observe the antitumor action of Fucoidan extracted from brown alga Undaria pinnatifida. MethodsThe mode of implanted S180 tumor was established in　inhibitory effect on tumor was observed in mice after Fucoidan was given　inhibitory effect in A549,HeLa and L1210cells by Fucoidan with the method of MTT was investigated in vitro. The immune function of Fucoidan to normal mice was detected through the experiment on the clearance rate of charcoal particles and delayed type hypersensitive reaction (DTH) induced by　showed significant inhibition on the growth of S180 tumor in a dose-dependent manner,but no significant anti-proliferative effects on A549,HeLa and L1210cells. The clearance rate of charcoal particles ,spleen index and ear edema induced by DTH were improved in high-dose and middle-dose groups. ConclusionFucoidan has antitumor action, and the mechanism maybe related to strengthening the immune function.
　　Key words：Fucoidan extracted from Brown Alga ; Antitumor
Fucoidan是一种从日本褐藻Undaria pinnatifida中提取的天然多糖类成分，含有4-单邻磺酸-L-岩藻吡喃糖。现有研究证明，从多种褐藻中提取的Fucoidan具有多种生物效应，如抗肿瘤、抗凝血、抗病毒等，已在日本作为功能食品、化妆品等广泛使用［1］。其抗肿瘤作用尤引起人们的关注。本实验以体内、体外方法，观察Fucoidan对小鼠S180移植性实体瘤、体外培养肿瘤细胞的作用，并了解其对动物免疫功能的影响，以对其抗肿瘤机理进行探讨，为其临床应用提供基础。
　　1 材料1 药品与试剂
　　Fucoidan由武汉和利有限公司提供，为黄褐色粉末，在水溶液中溶解度好。环磷酰胺：山西普德药业有限公司生产。Ⅳ型胶原酶、噻唑蓝、放线菌素D、脂多糖：购自Sigma公司；RPMI-1640培养基、新生牛血清：GIBCO公司生产。2动物及分组
　　昆明种小鼠，18～22 g，雌雄各半。体内抗肿瘤活性的检测实验将小鼠随机分为模型组，Fucoidan小、中、大剂量组及阳性对照组共5组，每组20只；对小鼠免疫功能的影响将小鼠随机分为对照组，Fucoidan小、中、大剂量组共4组，每组10只。Fucoidan小、中、大剂量组分别按1，2 ，3 mg/10 g灌胃给药，对照及模型组和阳性对照组同法给予等量生理盐水和 mg/10 g环磷酰胺，1次/d。3 瘤株
　　A549细胞、HeLa细胞、L1210细胞：由武汉大学典藏中心提供；荷瘤S180腹水型小鼠：由华中科技大学同济医学院提供。
　　2 方法
　　体内抗肿瘤活性的检测［2］
　　模型组和Fucoidan各组按剂量要求预防性灌胃给药7 d。第7天给药后1 h，由荷瘤S180腹水型小鼠体内无菌抽取腹水，显微镜下计数，以无菌生理盐水调整肿瘤细胞数至×1010/L，混匀后，每鼠右腋皮下注射肿瘤细胞悬液 ml。各组如前给药，连续2周，最后1次给药24 h，动物处死，并剖取各组动物皮下肿瘤，称重。与模型组比较，计算抑瘤率。
　　体外抗肿瘤活性的检测［2］
　　采用MTT法。10％RPMI 1640生长培养基培养细胞，收集对数期细胞，用2％RPMI 1640维持培养基调节细胞浓度，除空白调零孔外， 每孔均匀接种约2×104个细胞／180 μl到96孔板中。空白调零孔仅加入10％RPMI 1640 180 μl。37℃、饱和蒸气、5％CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁，37℃、饱和蒸气、5％CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁，然后除空白调零孔及正常对照孔外，每孔分别加入终浓度为5×10-1， 1×10-1， 5×10-2 ， 1×10-2，5×10-3，1×10-3，5×10-4，1×10-4mg/ml的Fucoidan20 μl，每个浓度各设4个复孔，正常对照孔仅加入PBS 20 μl。因Fucoidan有颜色，每个浓度组均设一不加细胞，只加20 μl 相应浓度培养液的对照孔。Fucoidan继续培养48 h后， 弃去孔内液体，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl, 37℃、饱和蒸气、5％CO2培养箱放置4 h。每孔加入DMSO 20 μl,37℃、饱和蒸气、5％CO2培养箱放置30 min后，平板离心机2 000 g×10 min离心后，低速振荡15 min, 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的光密度值。给药各组所测OD570需减去对照孔OD570。
　　对正常小鼠免疫功能的影响
碳粒廓清法［3］：各组按分组灌胃给药7 d, 1次/d。最后一次给药后1 h，每只小鼠尾静脉注射经稀释的印度墨汁 ml/kg，注毕即刻计时。在注射墨汁后3 min和13 min，分别以预先用肝素处理过的玻璃毛细管刺入小鼠眼内眦取血 ml，将所取血液加入含％Na2CO3 2 ml的试管中，摇动试管使均匀混合，在分光光度计上测定600 nm波长处每个样品的光密度值, ％Na2CO3液作空白对照。称重肝脾 末次取血后，立即颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脾，去除脂肪和结缔组织，滤纸拭干后分别称重记录。并计算清除速度K值、吞噬指数α和脾、胸腺脏器指数：

　　清除速度K值K=LgOD1-LgOD2t2-t1
吞噬指数α：α=体重肝重-脾重×3K
脾、胸腺脏器指数＝器官重量/体重×10
2，4-二硝基氟苯诱导迟发性变态反应［2］：各组按分组灌胃给药7 d，1次/d。第7日给药后，每鼠腹部剪毛，均匀涂抹1% DNFB 50 μl致敏，继续用药后第5天再用1% DNFB10 μl攻击右耳，24 h后处死动物，用打孔器取下直径8 mm耳片，称重，以左右耳重量之差来表示DTH程度。
　　统计学处理
　　数据均以±s表示，两组间均数比较采用t检验。
　　3 结果
　　Fucoidan对S180实体瘤的抑制作用
　　肉眼观察，模型组小鼠瘤块不断增大，边界不清，不易剥离，而Fucoidan小、中、大各剂量组瘤块与周围组织界限较清楚。表1所示，Fucoidan能明显抑制小鼠S180实体瘤的生长，且呈现剂量相关性，其抑瘤率达到环磷酰胺阳性对照的%～％，提示具有有效的抗肿瘤生长作用。表1 海藻提取物对小鼠S180实体瘤重量的影响
　　Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的影响
　　结果见表2。Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的A570均无显着影响。提示其并无直接杀伤肿瘤细胞的能力。表2 Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞OD570的影响
　　Fucoidan对正常小鼠免疫功能的影响
　　结果见表3。Fucoidan中剂量组和大剂量组能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数α和脾脏器指数，且呈现明显剂量相关性，但对胸腺脏器指数影响不大。在DNFB诱导迟发性变态反应实验中，Fucoidan中剂量组和大剂量组亦可使小鼠耳肿胀度增大。表3 Fucoidan对正常小鼠免疫功能的影响
　　4 讨论
大量药理及临床研究表明，海藻中的提取物具有有效的抗肿瘤作用［4］，特别是多糖成分，能提高机体的免疫功能，用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点［5］。本实验结果显示，海藻提取物Fucoidan能抑制小鼠移植性S180实体瘤的生长，具有确切的体内抗肿瘤作用。而就其机制而言，活性多糖一般是作为生物免疫反应调节剂，通过增强机体的免疫功能，尤其是非特异性免疫功能，而间接抑制或杀死肿瘤细胞的［6］。碳粒廓清实验是反映非特异性免疫功能的经典实验，能表现单核巨噬细胞系统的吞噬能力，活化的单核巨噬细胞对肿瘤细胞可产生直接的杀伤和抑制作用，在机体对抗肿瘤的环节中起重要作用。而DNFB诱导迟发性变态反应是机体细胞免疫功能的另一敏感指标，反映T淋巴细胞功能。Fucoidan能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数α、脾脏器指数和DNFB诱导迟发性变态反应。但Fucoidan对体外培养肿瘤细胞的生长并未显示确切的直接抑制作用，这种对细胞无毒的特点，明显不同于常用细胞毒类抗癌药。提示Fucoidan可能是通过增强免疫功能而发挥抗肿瘤作用。
【参考文献】
　　［1］Takeshi Teruya, Teruko Konishi, Shuntoku Uechi, et al. Anti-proliferative activity of oversulfated fucoidan from commercially cultured Cladosiphon okamuranus TOKIDA in U937 cells［J］. International Journal of Biological Macromolecules, 2007, 40(3): 221.
　　［2］徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学，第3版［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1785，1420.
　　［3］陈奇.中药药理实验方法学，第1版［M］. 北京：人民卫生出版社，1993：317.
　　［4］杨文豪，吕俊华，徐石海.海藻提取物A1和A2抑制肝癌和肺腺癌细胞增殖作用的实验研究［J］.辽宁中医杂志，2005，32：371.
　　［5］刘海洲，刘均红.海藻多糖的生物活性及医药应用研究新进展［J］.化工科技市场，2005，8：29.
　　［6］李玉芳，王杰.中药多糖抗肿瘤机制研究进展［J］.实用癌症杂志，2007，22：546.