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学生细胞生物学课题项目申请书

项目名称:

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一、 立项的背景和意义
心血管流行病学调查显示, 尽管近30年来心血管病死亡率除东欧各国外的大多数国家都有不同程度的下降, 但其仍是多数国家45岁以上男性第一位的死亡原因, 在女性则是仅次于肿瘤的第二位死因, 严重影响着人类的期望寿命和生存质量( 资料来源: 《世界卫生组织卫生统计年报》, 1993年日内瓦) 。中国已进入老龄化社会, 是世界上老年人口最多的国家, 预计到本世纪中叶, 老年人口将达到4亿。同时随着人们生活水平的不断提高、 膳食不当、 生活习惯和外部环境等多种因素, 近年来心血管疾病已成为中国发病率和死亡率高居第一的疾病[1], 严重影响着人们的生命健康, 其发病及防治受到全社会的极大关注。
二、 国内外研究现状和发展趋势
近年来, 分子生物学和细胞生物学的研究成果促使心血管药理学内容日新月异地更新, 对心血管病症的研究相对成熟, 大部分心血管相关基因研究比较清楚, 药物的作用靶点也相对明确[2].而中国传统中药丹参及其复方在治疗冠心病、 动脉粥样硬化方面以其疗效确切、 副作用小、 安全、 经济等优点, 成为临床最常见的治疗血瘀症冠心病中药。丹参为唇形科多年生草本植物丹参( Salvia miltiorrhiza) 的根茎, 始载于《神农本草经》。丹参的化学成分当前已研究得较为系统, 主要为共轭醌、 酮类化合物, 酚酸类物质, 具有较广泛的药理的作用, 其中对循环系统的影响研究得较多[3-4], 大量的药理学研究表明, 丹参具有抗心肌缺血、 舒张血管、 保护内皮损伤、 缩小心肌梗塞面积, 抗自由基、 减少缺血再灌注心肌损伤, 保护心肌高能磷酸化合物等广泛的心血管活性[5]。药代动力学研究结果表明, 丹参素和儿茶醛可经肌肉和胃肠道吸收入血, 隐丹参酮口服吸收较差或吸收后迅速被肝脏转化, 一部分首先转化为丹参酮ⅡA, 后者进一步被羟化代谢为含羟基代谢物, 并结合内源物使极性增大而利于排出。分子药理学的研究表明复方丹参可经过影响基因的表示调控达到治疗作用, 如丹参可抑制血管内皮细胞和粒细胞表示CD11b、 ICAM-1、 E-selectin等粘附分子[6-7], 抑制血管平滑肌细胞表面CD54等粘附分子表示, 降低血小板膜粘附分子CD41、 CD62P、 和P-选择素的表示, 丹参酮能够抑制心肌细胞c-jun基因的表示等[8-9]。国际上对其保护心血管作用的研究亦逐渐增多; 日本学者研究表明, 丹参提取物可抑制血小板聚集[10-11]; 台湾学者近期研究表明丹参提取物对TNF-α所致主动脉内皮细胞粘附分子表示的抑制作用呈剂量依赖关系[12]。但丹参保护心血管作用的药理研究仍不够深入, 特别是其作用途径、 靶标不甚明晰。王升启教授领导的研究组对复方丹参方保护心血管作用的分子机理以及四物汤化学成分组合补血作用及其机理研究进行了一定的探索[13], 并据此提出”化学基因组学”理论, 认为中药复方是经过化学成分组合影响到信号分子组合, 使紊乱的信号分子网络恢复平衡, 从而达到治疗中医的证和相关疾病的作用和效果[14-15]。本项研究旨在探索中药丹参保护心血管作用的分子机理, 经过化学组学、 基因组学及蛋白质组学技术发现其作用的”组合靶标”, 在”化学基因组学”研究技术平台层面上进行成分-靶标相互作用研究, 进而验证丹参保护心血管作用的靶标以及找到疗效确切、 安全经济的单体及其组合, 为高技术含量的中药研发、 产业现代化和国际化提供一些基础数据。
三、 项目主要研究开发内容和技术关键
1.主要研究开发内容
1.1 基于表示谱的生物信息学药靶发现
利用靶标相关基因芯片、 蛋白质组学和基于表示谱的生物信息学药靶发现技术, 从血淤证模型中发现候选靶标。
1.2 基于化学基因组学的成分-靶标相互作用研究
采用实时荧光RT-PCR、 WESTERN印迹等技术, 在血瘀证模型( 血管内皮、 平滑肌、 心肌及血小板) 上观察有效单体及组合对各作用靶标及其通路和网络的调控作用, 初步确定各有效成分作用的靶分子及特异性;
然后采用生物质谱及亲和色谱等技术, 在分子水平上分析有效成分与靶分子的结合性能, 从而验证成分和靶标的可药性;
最后在动物体内验证有效成分( 组合) 对靶标( 组合) 作用的有效性。经过基因芯片及蛋白质组技术实验初筛获得8-15个潜在靶标, 并进一步经过生物信息学筛选4-5个候选靶标, 结合反义及siRNA技术, 对候选靶标进行特异性验证, 获得1-2个丹参有效成分的作用靶标。
针对上述靶标, 研究丹参有效成分及其组合( 配伍) 对其表示和调控的影响, 获得成分与靶标相互作用的实验数据。
2.关键技术
基因表示谱分析: 结合生物信息学分析, 筛选心血管相关基因并制备相应的表示谱分析芯片。利用该芯片研究丹参方有效成分及其组合在细胞和动物模型上对靶细胞和组织基因表示谱的影响, 经过软件分析找出差异表示基因。
蛋白质表示谱分析: 将对照及模型组的蛋白质分别进行荧光标记后, 进行双向电泳, 结果用扫描仪扫描并采用蛋白质组学分析软件( Imagemaster 2D Elite图象分析软件、 Imagemaster 2D Database数据库软件) 进行分析比较, 找到特异表示蛋白, 并对特异蛋白进一步采用质谱分析其结构和功能。
候选靶标的生物信息学筛选: 采用本室开发的基于基因表示谱的基因分类系统Tclass和基于表示谱的样本类型自动识别的整合方案SamCluster进行靶标筛选和生物信息学验证, 结合功能基因组和疾病基因组研究成果, 筛选出候选靶标。
基于化学基因组学的”成分-靶标”相互作用关系分析: 根据有效成分、 靶标选择均匀、 正交或析因等统计学方法设计实验, 并对数据以简单相关分析、 典型相关分析、 多元回归分析等多种分析方法分析”成分-靶标”相互作用关系。
3.拟解决的关键问题
3.1分子间相互作用网络的构建及基于表示谱和分子相互作用网络的组合靶标筛选方法
心血管疾病是研究相对成熟的疾病, 大部分心血管相关基因研究比较清楚、 药物作用的靶点也相对明确。我们拟基于现有心血管疾病相关基因及功能、 生物信息学、 蛋白质/基因表示谱、 酵母双杂交及药理学等研究基础, 参考文献软件及数据库等信息资源, 构建心血管相关基因和药物靶标的分子相互作用网络。在我们原先建立的基于基因芯片表示谱聚类、 分类软件及算法的基础上, 进一步建立基于心血管疾病相关基因网络的组合靶标筛选方法。
3.2丹参有效成分组合的选择:
根据前期文献及本实验室研究工作基础, 采用丹参的有效部位丹参总酮、 丹参总酚酸、 丹参总提物及其主要有效成分丹参酮IIA、 丹参素、 丹酚酸B、 原儿茶醛等几种单体成分, 分别在有效部位及有效单体两个层次上进行正交或析因设计, 结合细胞、 血小板聚集等高通量模型, 初步筛选出其候选有效成分组合2-3组。对候选组合进一步在动物模型上进行系统的药理学验证, 选出有效成分组合。该组合及其成分能够作为组合靶标的发现和功能验证工具药。
3.3 有效成分-组合靶标间交互作用关系的实验设计及学分析
采用均匀、 正交或析因设计、 基因芯片及Western印迹研究其不同组份的有效组合对组合靶标表示的影响; 采用”典型相关分析(canonical correlation analysis)”等统计学方法, 研究各有效成分对组合靶标表示调控的协同效应
四、 项目预期目标
A．建立”化学基因组学”研究技术平台, 并据此阐明丹参保护心血管作用机理;
B．发表 3-5篇高水平SCI论文, 申请1-2项专利, 培养4-5名本科生。
五、 项目实施方案、 技术路线、 组织方式与课题分解
1.项目实施方案:
利用生物芯片技术结合蛋白质组学、 化学组学、 生物信息学及统计学等技术, 在分子、 器官及整体水平上发现丹参作用的心血管疾病相关基因和蛋白表示调控靶标以及功能验证, 进一步将作用不同靶标的有效成分进行配伍, 并利用上述技术平台进行验证, 以期发现丹参有效成分为基础的最佳”分子配伍”。从而实现多层次、 多靶点、 多学科地研究、 阐明丹参保护心血管作用的物质基础及分子机制, 并为探讨配伍的科学内涵提供实验数据。
1.1丹参有效成分的分子作用通路的筛选
选择丹参提取物及其有效成分, 采用细胞和动物模型, 用基因芯片和蛋白质组学等高通量分析技术, 研究其对基因和蛋白表示谱的影响, 采用生物信息学软件(Image 4.0、 Arraysight、 Imagemaseter 2D Elite图象分析软件、 Imagemaster 2D Database 数据库软件) 进行差异比较分析。结合表示谱数据及文献数据库构建心血管相关基因网络。采用开发的Tclass和Samclass进行聚类和分类分析, 结合功能和疾病基因组学手段和知识筛选出丹参有效成分作用的分子作用通路。
1.2丹参有效成分的分子作用通路的功能验证
对发现的候选组合靶标进行分析, 如果是已知功能基因或蛋白质则直接进行组合筛选; 如果是新基因或蛋白质则首先进行结构和功能研究; 然后采用反义核酸、 siRNA技术, RT-PCR技术, Western 印迹技术等在细胞和动物模型上对丹参有效成分的分子作用通路进行组合功能验证。
1.3丹参有效成分最佳”分子配伍”的筛选
进一步用丹参有效单体的不同成分、 不同剂量、 不同比例的配伍依次在细胞和动物模型上对候选组合靶标进行验证, 在”化学基因组学”研究技术平台层面上进行有效成分配伍研究, 以期找到疗效确切、 安全经济的单体及其组合。
2.技术路线( 课题分解) :
2.1 设计并制备人心血管相关芯片:
根据心血管疾病相关文献, 设计并制成低密度的寡核苷酸芯片。从Cardio 数据库(Cardiovascular Disease Related Database )中找出大约400种心血管疾病相关基因, 这些基因的人类mRNA 序列来自GenBank。 使用大规模探针设计软件Mprobe来设计寡核苷酸探针, 芯片质控方法采用阳性对照结合看家基因和阴性对照, 对逆转录、 杂交过程进行监测和结果分析。
2.2 建立损伤的细胞模型:
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的形成涉及许多环节, 包括脂质代谢紊乱, 血管内皮细胞损伤, 平滑肌细胞增殖, 从中层迁移到内膜下, 单核和巨噬细胞的迁移、 增生和分化, 泡沫细胞的形成, 细胞的坏死和脂质沉积等。本项研究拟建立以TNF-α (2ng/ml)、 oxLDL (12.5μg/ml)损伤的血管内皮、 平滑肌、 心肌及血小板模型。
2.3 丹参主要单体对人血管内皮细胞、 平滑肌细胞、 心肌细胞等药理作用的筛选:
选择药理试验剂量范围; 凋亡保护试验; 白细胞粘附试验; 凝血纤溶物质( PAI-1, tPA) 分泌; NO分泌; 内皮素-1分泌; 平滑肌细胞增殖实验。
2.4 丹参有效成分保护心血管作用的表示谱及蛋白质组学研究:
丹参有效成分孵育内皮细胞、 平滑肌细胞等6-12小时, 再以TNF-α、 oxLDL刺激6小时, 提取细胞的RNA及总蛋白进行表示谱及蛋白质组学研究, 发现差异表示基因及蛋白, 作为丹参有效成分的潜在靶标。
2.5 丹参有效成分保护心血管作用的机理研究及靶标验证:
以反义核酸、 siRNA技术, Q-RT-PCR、 Western Blot及通路抑制剂等技术研究丹参有效成分及其组合保护心血管作用的分子机制及功能验证。
2.6 丹参有效成分保护心血管作用的动物试验及临床观察:
2.6.1 观察丹参活性组分对实验性动脉粥样硬化家兔的治疗作用。雄性新西兰兔高血脂饲养12－16周形成实验性的动脉粥样硬化, 给予高脂饮食同时给予丹参活性成分, 4, 8, 12, 16周末采血检测血流变、 血脂情况, 于16周时处死, 测定血脂变化TC、 TG、 LDL-C, 血清和血管壁中NO和ET－1的含量变化。测定颈动脉受损内皮细胞黏附因子VCAM－1的变化。与阳性对照药复方丹参方及辛伐她汀比较。
2.6.2 观察丹参活性组分对实验性高血脂症家兔的治疗作用。雄性新西兰兔高血脂饲养2周形成实验性的高血脂症, 然后分组连续给予高脂饮食和丹参活性成分, 4周后高脂给量减半, 继续给予丹参动脉粥样硬化活性成分至6周, 测定给药后4和6周时的血脂变化TC、 TG、 LDL-C, 血清和血管壁中NO和ET－1的含量变化。测定颈动脉受损内皮细胞黏附因子VCAM的变化。与阳性对照药复方丹参方及辛伐她汀比较。
2.6.3 观察丹参活性组分对大鼠缺血再灌注(Ischemic reperfusion injury, IRI)的影响, 对血栓烷Ａ2和前列环素(TXA2/PGI2)比值的调节作用, 以及一氧化氢(NO)、 内皮素(ET－1)、 纤维蛋白原(Fig)水平, 改进血液流变性等作用, 改进ＩＲ的病理生理。与阳性药物复方丹参方比较。
2.6.4 观察丹参活性组分对高黏滞血症家兔和急性高黏滞血症模型大鼠血管内皮分泌功能的影响, 采用复合因素( 高分子右旋糖酐、 肾上腺素、 牛血清白蛋白) 、 长时间(11d)造成高黏滞血症慢性模型; 采用１次性静脉注射高分子右旋糖酐, 皮下注射肾上腺素造成急性高黏滞血症模型。分别用丹参活性组分进行治疗, 观察血管内皮细胞分泌功能的变化及丹参活性组分的干预效果。检测指标: 红细胞变形能力, 红细胞比容、 红细胞聚集指数, 红细胞电泳时间; 血液流变性; 全血比黏度、 血浆纤维蛋白原; 血小板聚集和黏附性及TXB2、 6－Keto－PGF1α的含量的影响; 血管细胞黏附因子VCAM、 ICAM、 E－SLECTIN的表示。阳性药物为复方丹参方和阿司匹林。
2.6.5 在临床上选择高血脂症患者, 中医诊断符合血瘀证标准的患者, 观察经丹参注射液治疗后血脂、 血流变, 血清NO和ET－1含量的变化, 以及颈动脉斑块面积的变化。阳性对照药物为复方丹参方和辛伐她汀。

技术路线:
2.1基于表示谱的生物信息学药靶发现:
加药后
加药前
血瘀证
细胞/组织/血清
丹参有效成分
药靶基因芯片
潜在药靶基因
基因/蛋白质
表示谱分析
蛋白质组学技术
候选靶标
基于表示谱的生物信息学分析
干预

2.2基于化学基因组学的成分-靶标相互作用研究
血瘀症动物模型( 实验性动脉粥样硬化家兔, 实验性高血脂症家兔, 大鼠缺血再灌注)

血瘀症细胞模型( 血管内皮细胞, 平滑肌细胞, 心肌细胞)

丹参有效成分及其组合

潜在药靶( 受体、 激酶、 信号分子等)
病理组织检查
生化指标( 血脂变化TC、 TG、 LDL-C, 血清和血管壁中NO和ET－1的含量变化)

信号通路和药理学验证( Q-RT-PCR, Western Blot, Elisa, etc.)

丹参保护心血管作用的靶标

丹参有效成分作用于血瘀型冠心病模型, 采用基因芯片和蛋白质组技术分析其对基因和蛋白表示谱的影响, 找出差异基因及蛋白质, 并经过PR-PCR、 Western印迹等技术进行验证, 发现该成分保护心血管的分子作用通路。
进一步用丹参有效成分的不同成分、 不同剂量、 不同比例的组合依次在细胞和动物模型上对候选组合靶标进行验证, 在”化学基因组学”研究技术平台层面上进行成分-靶标相互作用研究, 进而验证丹参保护心血管作用的组合靶标以及找到疗效确切、 安全经济的单体及其组合。
六、 计划进度安排
.6- .12: 丹参有效成分作用靶标的筛选及生物信息学验证。经过基因芯片及蛋白质组技术初筛得到8-15个潜在靶标, 并进一步经过生物信息学筛选4-5个候选靶标。
.1- .12: 丹参有效成分作用靶标的实验验证。结合反义及siRNA技术, 对候选靶标进行特异性验证, 获得1-2个丹参的作用靶标, 针对上述靶标, 研究丹参有效成分及其组合( 配伍) 对其表示和调控的影响, 获得成分与靶标相互作用的实验数据。
.1- .12: 丹参有效成分与靶标相互作用研究及验证。经过靶标的功能基因组及疾病基因组分析, 设计出1-2组最佳成分组合, 并在动物模型上对其药理作用及靶标表示和调控进行实验验证, 获得最佳成分配伍及其作用靶标; 并归纳出丹参有效成分与靶标相互作用关系。
七、 现有工作基础和条件
本研究所具有20多年从事中医中药研究的经验和一支成熟的科研队伍, 拥有近3000平方米的实验室, 包括中药制剂研究室, 细胞实验室、 细胞培养室( 无菌室) 、 蛋白质组学实验室、 遗传与分子生物学实验室、 微生物与免疫实验室、 生物化学实验室, 由细胞生物学、 生物化学、 微生物与免疫、 遗传学、 分子生物学和中药制剂分析等学科支撑, 是浙江省中西医结合基础重点实验室和国家中医药管理局脂代谢三级实验室以及省教委蛋白质组学重点实验室。有配制先进的实验动物房, 能提供实验用的清洁级实验动物。现有正教授2人, 副教授5人, 其它专业技术人员20人。可开展药物制剂, 蛋白检测、 生化分析等研究。有从事本研究用的相关设备, 如冷冻超高速和高速离心机、 蛋白液相分离层析系统、 核酸电泳仪、 双相电泳系统、 核酸定量测定仪、 紫外分光光度计、 酶标仪、 荧光分析仪、 紫外凝胶成像系统、 超净工作台、 倒置荧光显微镜、 超低温冰箱、 液氮罐、 各种培养箱等等。本实验室与奥地利格拉茨大学生物化学研究所建有所际关系; 与德国Max-Plank生物物理研究所和中科院上海生物化学与细胞生物研究所具有良好的合作关系。
八、 经费预算
九、 参考文献
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