pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用.docx
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1、pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用【摘要】 目的: 观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Adpten)体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞后的表达,并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用. 方法: 利用AdEasy腺病毒载体系统构建Adpten,体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞,荧光显微镜检测Adpten的转染效率. Western印迹检测pten在HO8910PM细胞中的表达;MTT实验观察pten对细胞生长的影响;HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影响;细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用;Hoechest33258凋亡
2、染色检测pten基因对HO8910PM细胞凋亡的诱导作用. 结果: 外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO8910PM细胞,Western印迹检测出有PTEN蛋白的表达,当感染复数MOI为100时,体外转染效率高达90%以上. pten显着抑制HO8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移. 结论: 重组腺病毒是高效的基因转移系统,能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO8910PM细胞中,对细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用,并能抑制其迁移.【关键词】 卵巢肿瘤;基因治疗;pten基因;腺病毒;细胞凋亡;迁移抑制 0引言 抑癌基因pten,即第10号染色体缺失的与张
3、力蛋白同源的基因,是继p53后又一个与多种肿瘤发生发展密切相关的抑癌基因,其编码具有双重特异磷酸酶活性的蛋白,可以反向调控磷脂酰肌醇(3)激酶/AKt信号传导途径,从而抑制细胞生长增殖. 其突变和缺失多发于乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等1-3. 在某些pten基因突变或缺失的癌细胞中过表达PTEN蛋白能抑制细胞增殖和肿瘤的形成,使其细胞周期停滞在G1期并发生细胞凋亡4-5,而且在某些没有pten基因突变的癌细胞中,使pten基因过表达也能抑制这些癌细胞生长,诱导其发生凋亡6;另外,pten基因还能抑制癌细胞的侵润转移,降低其迁移能力. 这就提示pten基因用于癌症基因治疗有着重要意义. 而基因治
4、疗载体的选择最为重要,当今运用最多最广泛的就是腺病毒(adenovirus, Ad)载体,其具有在哺乳动物及其他多种生物细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性和不整合宿主细胞的性质,是一种比较安全,转染效率又高的载体7. 本研究采用携带野生型pten基因的重组腺病毒(Adpten),将pten基因导入人高转移卵巢癌HO8910PM细胞,观察其在卵巢癌细胞中的表达,研究其对卵巢癌细胞生长抑制、迁移抑制、诱导凋亡的作用,对卵巢癌的基因治疗进行初步的探索并提供有意义的参考数据. 1材料和方法 材料人高转移卵巢癌HO8910PM细胞和人胚肾细胞293T购自中国科学院上海细胞生物学研究所;野生型pten表
5、达质粒为美国加州大学Frank Furnari教授惠赠;AdEasy腺病 毒表达载体系统由美国休斯霍华德医学院及John Hopkins肿瘤中心Bert Vogelstein教授惠赠,其中穿梭载体pAdTrackCMV带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp),在表达外源基因同时也能单独表达gfp,用于重组腺病毒的快速筛选以及转染率的测定;抗PTEN抗体为美国Santa Cruz公司产品; HRP标记羊抗鼠IgG抗体和马抗山羊IgG均购自北京生物技术有限公司;MTT为美国Amerson公司产品. Hoechst33258 细胞凋亡染色试剂盒购于武汉碧云天生物技术公司. 方法 重组腺病毒载体的构建及细胞
6、培养应用细菌内同源重组的方法,构建携带野生型pten基因的重组腺病毒Adpten及阴性对照Adgfp 8. HO8910PM细胞培养于含100 mL/L小牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养液中,置50 mL/L CO2, 37孵箱培养. pten转染效率的测定取指数生长期的高转移卵巢癌HO8910PM细胞,以5104/孔接种于6孔培养板中,24 h后吸弃培养基,换无血清RPMI1640培养基,用25,50,100感染复数(multiplicity of infection, MOI=病毒颗粒数/转染的细胞数)的腺病毒感染, 培养6 h后,换完全培养液继
7、续培养. 24 h后在荧光显微镜下计数gfp阳性细胞百分率. 确定HO8910PM细胞转染所需的MOI值,使得转染效率90%. Blot检测转染细胞表达的PTEN蛋白取对数生长期细胞,按2106接种于25 cm2培养瓶中. 常规条件培养24 h后,按MOI=100加入病毒,设Adpten 组和Adgfp 组,培养6 h后,换完全培养液继续培养. 48 h后提取细胞总蛋白;以Bradford酶标仪蛋白定量法测定蛋白含量,然后作SDSPAGE,于4冰箱中90 mA恒流电转过夜,使目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上,封闭液于4封闭过夜,将膜转至新的封袋中,按 mL/cm2加入适量的一抗稀释液,封口后,室温
8、下平缓摇动反应4 h. TBS洗涤后加入二抗稀释液,同条件反应1 h. 大量TBS洗涤去除未结合的二抗. ECL处理,暗箱中以X光胶片曝光,显影、定影. 法测定HO8910PM细胞增殖抑制率取对数生长期细胞,以5103/孔接种于96孔板培养,常规条件培养24 h后,吸弃培养基,换无血清RPMI1640培养基,按MOI=100加入病毒,设Adpten 组,Adgfp组,PBS空白对照组和本底对照组(只加完全培养液,不种细胞),培养6 h后,换完全培养液继续培养. 每个时间点设6个平行孔,在指定时间(24,48,72 h)加入MTT (5 mg/mL) 20 L/孔,孵育4 h后,小心吸弃孔内上清
9、液,加入DMSO 150 L/孔,振荡10 min,490 nm作为测定波长,570 nm作为参比波长,在酶标仪上测定各孔的光吸收值. 细胞增殖抑制率=1-实验组/本底对照组100%. 染色观察细胞形态取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞,以5104接种于35 mm培养皿中,24 h贴壁后,加入Adpten或Adgfp感染,并设加PBS为空白对照;病毒感染方法同,24 h后弃培养基,生理盐水漂洗,950 mL/L乙醇固定15 min,苏木素染色310 min,自来水冲洗58 min, 510 mL/L盐酸酒精分化数分钟,自来水冲洗58 min,然后加温热水510 min显蓝,自来水充分
10、冲洗,伊红复染2 min,再次用自来水充分冲洗,普通光学显微镜下观察. 细胞划痕试验取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞,按2104/孔接种于6孔培养板,用RPMI 1640完全培养基孵育24 h后,用移液枪枪尖在细胞培养基表面划一条痕迹,用PBS洗3次后加入无血清RPMI1640培养基,病毒感染方法同,设加PBS为空白对照,继续培养48 h后镜下观察. 凋亡染色取对数生长期HO8910PM细胞2104/孔接种于6孔板,病毒感染方法同,设加PBS为空白对照,48 h后用固定液固定10 min,PBS洗2次,Hoechst33258 染色5 min,荧光显微镜下观察. 统计学处理: 本实
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