浅论抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定.docx
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1、浅论抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定【摘要】 目的:纯化rVVC免疫家兔,制备并纯化多克隆抗体。观察复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合作用肝癌细胞SMMC7721后,肝癌细胞SMMC7721形态学和活性变化,评估抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC772的保护作用。方法:纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳兔获得多克隆抗体,多克隆抗体经过硫酸铵盐析、Sephadex G25除盐和DEAE-Sephadex G100层析纯化并进行 Westerm Blot鉴定和抗体效价分析。复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合物作用肝癌细胞
2、SMMC7721后,显微镜观察并以MTT法确定抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC7721的保护作用。结果:兔抗重组rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后,得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示,抗重组rVVC蛋白多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。显微镜观察和MTT结果表明,纯化多克隆抗体能够阻断重组rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC772的损伤。结论:成功制备了具有保护和阻断作用的兔抗重组rVVC多克隆抗体,为以后rVVC促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。【关键词】 创伤弧菌溶细胞素;多克隆抗体;保护作用;阻断作用 Abstra
3、ct: Objective: To prepare and purify rabbit polyclonal antibody against rVVC,to evaluate the protection of polyclonal antibody by observing the morphology and activity changes of SMMC7721 cells acted by purified rVVC,purified polyclonal antibody,the mixture of rVVC and polyclonal antibody. Method: R
4、abbit polyclonal antibody against rVVC prepared by immunning rabbit was purified by persulfate,Sephadex G25 and DEAE-Sephadex G100 followed by analysis of Western Blot hybridization and antibody titer. After SMMC7721 cells were acted by purified rVVC, purified polyclonal antibody and the mixture of
5、VVC and polyclonal antibody, rabbit polyclonal antibody protection were observed under microscope and with MTT method. Result: Rabbit polyclonal antibody against rVVC was purified successfully by methods of Persulfate, Sephadex G25 and DEAE-Sephadex G100. Polyclonal antibody showed high immunoreacti
6、vity. The results of MTT and microscope observatien indicated that polyclonal antibody could block up the damage of SMMC7721 cells acted by rVVC. Conclusion: Rabbit polyclonal antibody against rVVC with functions of protection and blockade is prepared successfully, thus to provide a significant bloc
7、king agent for further study on mechanism of inflammation,stress and signal transduction of rVVC. Key words: vibrio vulnificus cytolysin;polyclonal antibody;protection;blockage 创伤弧菌是一种致病性极强的嗜盐性细菌,能引起严重的伤口感染和败血症,发病急、病死率高,发展到败血症,则病死率高达55%以上,其确切致病机制至今尚未完全阐明。创伤弧菌溶细胞素作为创伤弧菌唯一分泌至细胞外、具有创伤弧菌种属特征性的外毒素,其活性和毒性
8、都很强,现在认为它是创伤弧菌感染最重要的毒力因子,在创伤弧菌感染过程中发挥重要致病作用1。此前,我们已经成功构建了原核表达载体pET28a(+)-vvhA,并对重组蛋白rVVC表达、纯化和复性条件进行优化。本研究中,我们利用纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳兔,进行多克隆抗体制备并纯化,成功制备了兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体,并对其保护、阻断作用进行了评价,为后续rVVC的促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。 1 材料和方法 材料载体与细胞:重组原核表达载体pET28a(+)-vvhA为本课题组构建,肝癌细胞SMMC7721为温州医学院细胞与分子生物学研究所保存,日本
9、大耳兔4个月大小、雄性、健康,体重kg由温州医学院实验动物中心提供,兔红细胞利用心脏采血法取自健康家兔心脏。主要试剂与试剂盒:IPTG、3S NTA RESIN树脂、盐酸胍购于上海申能博彩生物科技有限公司。羊抗兔HRP-IgG抗体、ECL发光试剂购于上海普飞生物技术有限公司。DMEM高糖培养液购自吉泰科技有限公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。青霉素/链霉素抗生素液为美国Invitrogen公司产品。pH 磷酸盐缓冲液、%胰蛋白酶、2%台盼兰染液自配。方法重组蛋白rVVC的表达、纯化、Western blot 分析和柱上复性:参照本课题组已经建立的方法表达、纯化重组rVVC蛋白。重组
10、蛋白rVVC的Western blot分析按文献进行。将纯化重组蛋白rVVC用PBS溶液稀释成浓度小于1 mg/ml,4 条件下,取1 ml样品加到Ni-NTA亲合层析柱中,流速控制在15 ml/h左右,进行蛋白质挂柱。层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗脱,流速控制在30 ml/h左右。再分别用3倍NTA体积的、 mol/L盐酸胍洗脱,流速控制在15 ml/h左右。3倍NTA体积的NTA-1 000 Buffer洗脱,收集洗脱液并用PBS溶液透析24 h,期间要求多次更换透析液。取透析好的蛋白溶液于4 、12 000 r/min离心取上清液,以考马斯亮蓝进行蛋白质定量分析,滤过
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