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微生物实验室操作规程

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2020年4月19日
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微生物实验室操作规程【SOP 】
• 细菌室工作守则（微生物室 SOP 之一）
• 细菌室消毒隔离措施（微生物室 SOP 之二）
• 微生物实验室安全与防护（微生物室 SOP 之三）
• 细菌室内质控制度（微生物室 SOP 之四）
• 细菌室操作技术规范（微生物室 SOP 之五）
• 无菌间规章制度（微生物室 SOP 之六）
• 菌（毒种）管理办法（微生物室 SOP 之七）
• 细菌室仪器维护保养及质控措施 （微生物室 SOP 之八）
• 标准菌株保存及使用（微生物室 SOP 之九）
• 细菌室内务管理规定（微生物室 SOP 之十）
• 标本采集及保存要求 （微生物室 SOP 之十一）
• 室内质控失控处理程序（微生物室 SOP 之十二）
• 标本拒收标准（微生物室 SOP 之十三）
• 温度失控处理措施 （微生物室 SOP 之十四）
• 超净工作台作业指导（微生物室 SOP 之十五）
• 标本的接种和移种法（微生物室 SOP 之十六）

细菌室工作守则
（微生物室SOP 之一）

1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。
2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。
3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。
4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。
5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。
6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。
7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于 3%来苏儿溶液中 5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净；如误入口内，应立即吐出，并用 1:1000 高锰酸钾溶液或 3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。
8.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用 3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗；如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。
9.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品（如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等）必须远离火源，妥善保存。
10.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、用具等放回原处，清理台面，未污染的废弃物扔进污物桶，有菌废弃物应送高压灭菌后处理。
11.离室前工作人员应将双手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗净。
12.爱护仪器设备，经常清洁，注意防尘和防潮。

细菌室消毒隔离措施
（微生物室SOP 之二）

1.每天工作前用消毒液消毒工作台，上班前、下班后开紫外灯（最少半小时）进行空气消毒。
2.非必要品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。
3.使用后的载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。
4.试验后的血液标本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于试验的反应板、吸头等用消毒液浸泡（至少 24 小时以上）后清洗或丢弃。
5.所有微生物培养物（细菌、支原体、真菌等培养物），不论标本阳性或阴性均用消毒液浸泡后，经煮沸消毒，才能清洗或丢弃。
6.取材、最好采用一次性工具，不能采用一次性工具者，每次取材前均应彻底消毒。
7.用于浸泡各种器械如刮菌刀、持物钳、镊子等的消毒液要定期更换。
8.不慎发生临床标本或培养物污染工作台，不要立即用水冲洗，应先用纸巾、布等敷料加上消毒液（如 5%石炭酸、3%来苏儿等）消毒 30 分钟以上，然后再清洗。如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。
9.实验时手部污染，应立即用肥皂洗手并冲洗干净，再外用消毒药水，如误入口内，应立即吐出，并用 1:1000 高锰酸钾溶液或 3%双氧水漱口，必要时根据实际情况服用有关
药物。

微生物实验室安全与防护
（微生物室 SOP 之三）

1．在工作区内禁止饮食，吸烟和存放食物及使用化妆品。
2．实验室里应保持整洁，不存放与工作无关的杂物。
3．工作台每天至少用消毒剂清洁一次，在溢渗传染物后要立即消毒、清洗；进入无菌室必须穿工作服，戴口罩、帽子。
4．在各种操作进程中均应尽量避免或减少气溶胶产生。
5．实验工作区禁止无关人员出入，特别要严禁儿童进入。
6．工作人员在处理传染性物质或动物之后，以及在离开实验室时要洗手。
7．凡发生溢漏事故或接触传染性物质后，均应立即报告实验室监督员或实验室主任，并做好书面记录及采取相应措施。
8．结核杆菌的培养及标本涂片务必在生物安全柜里操作。
9. 有涉及感染性材料的操作应在生物安全柜中进行，如结核杆菌培养、感染性组织等。
10. 工作人员在进入实验室工作区前，应在专用的更衣室（或缓冲间）穿着背开式工作服或其它防护服。工作完毕后必须脱下工作服，不得穿工作服离开实验室。可再次使用的工作服必须先消毒后清洗。
11. 工作时必须戴手套（两副为宜）。一次性手套必须先消毒后丢弃。
12. 在实验室中必须配备有效的消毒剂、眼部清洗剂或生理盐水，且易于取用。可配备应急药品。

细菌室内质控制度
（微生物室SOP 之四）

1、每位工作人员必须加强质控意识，以质量控制工作为核心，认真做好各项质控试验和记录。
2、加强质量控制和专业理论知识的学习，规范操作，正确分析处理结果。
3、一旦发现失控，及时采取相应措施，纠正失控结果。
4、每天观察培养箱、冰箱的温度，并做好记录。
5、无菌间每周监测一次，紫外线消毒灭菌情况，并做好记录。
6、每月对高压蒸汽灭菌器、干热鼓风干燥箱进行一次灭菌效果监测。

生物检验室操作技术规范
（微生物室 SOP 之五）

1、微生物检验室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌知识。
2、微生物检验专业人员不断更新知识，了解微生物检验新进展。
3、每次发出的微生物报告应认真复审，分析报告、评价报告。
4、工作人员加强有菌观念，无菌操作。
5、当工作环境被细菌污染，必须立即消毒处理，报告主管人员，采取必要措施。
6、工作人员被细菌培养物污染应消毒处理，必要时给予药物治疗，并向主管负责人报告，采取特殊措施。

无菌间规章制度
（微生物室 SOP 之六）
1、每一个工作人员必须树立无菌观念，严格进行无菌操作。
在无菌室内必须戴帽子、口罩，进行无菌操作。
2、每天用紫外线消毒，每月检查一次紫外灯的无菌效果。
3、无菌室内各种废弃物品必须消毒。
4、实验完毕后，用含氯制剂 1000mg/L 消毒桌面、地面。

菌（毒种）管理办法
（微生物室 SOP 之七）
1. 菌种保管应有专人负责，保存于冰箱中，房门专人加锁，确保菌种安全。保管人员变动时，必须严格交接手续。
2、菌种应有严格的登记，包括形态，分离日期，鉴定日期，签发者，主要鉴定性能（包括形态、染色、抗原结构、动物致病力等），并注明使用、转移、销毁情况及原因。
3、各种菌种应按规定时间接种，一般在接种三次后作一次全面的鉴定，注意菌种有无污染及变异，如发现变异时，应及时更换。
4、菌种保存范围及向外单位转移，应按国家卫生部规定执行。
5、所有存在菌种应具备清单。

细菌室仪器维护保养及质控措施
（微生物室 SOP 之八）
我室主要仪器为 BacT/Alert 120、BACTEC9050 血培养仪和 Vitek32
、BD 凤凰全自动细菌鉴定和药敏分析仪，为了使仪器能够高质量的运行，使仪器报告的结果准确可靠，特制定以下仪器维护、保养和质控措施。
一、BacT/Alert 120 、BACTEC9050 血培养仪的维护、保养和质控措施
1.每天上班开始工作前和下班离开前要检查仪器的工作状态是否正常，仪器培养箱温度的报告里外是否一致。
2.每天用中性的清洁液将仪器表面擦拭干净
3.每天先做质控。
4.一个月至少做一次全程定标。
5.仪器检测数据每周星期六做备份。
6.仪器每一个月做一次彻底的清洁保养，包括清洁外壳、瓶孔、滤网等
7.仪器每年请工程师做一次检定工作。
二、Vitek32、BD 凤凰全自动细菌鉴定和药敏分析仪的维护、保养和质控措施
1.每天上班开始工作前和下班离开前要检查仪器的工作状态是否正常。
2.每天用中性的清洁液将仪器表面擦拭干净
3.购买的新批号的试剂都必须先做质控，质控合格后才能用于临床检测。
4.仪器检测数据每周星期六做备份。
5.仪器每一个月做一次彻底的清洁保养，包括清洁外壳、卡片架、滤网等
6.仪器每年请工程师做一次检定工作。

标准菌株保存及使用
（微生物室 SOP 之九）
概述：标准菌株是细菌室室内质控工作必不可少的、重要的生物资源，我室的标准菌株主要来自省临检中心的发放和从卫生部临检中心以及国家菌种保存中心购买所得，为了让标准菌株能够得到合理的应用，特制定以下规定。
1.对每批购买的标准菌株要做好登记，包括菌种的菌名、编号、购买时间、保存地点、记录人等
2.每次使用标准品都应作好使用记录，包括标准品的名称、编号、使用时间等。
3.购买的标准品初次使用时，应大量增殖，然后分装在含 10-15%
甘油的胰蛋白胨肉汤中，20℃以下保存。
4.新的标准菌株复苏最多不得超过三次，如超过三次将不在视为标准菌株使用。
5.标准菌株保存管一经溶化使用后，不得再次冻存。

细菌室内务管理规定
（微生物室 SOP 之十）
1.细菌室岗位分工与职责管理规定
1.1 概述
鉴于细菌室工作琐碎烦杂且千头万绪，为了使细菌室的工作能够保质保量地顺利完成，特将细菌室暂定为两个岗位，以明确工作范围、增强责任心、便于日常工作的完成。当然由于细菌室不同岗位工作量的随机性较大，故我室要求大家发扬既分工，又协作的精
神，共同完成细菌室工作。
1.2 岗位职责
各岗位工作人员要求严格按照作业指导书进行操作，高质量的完成本岗位工作，如遇到问题须提出经讨论解决。
1.3 岗位分工
岗位Ⅰ：完成细菌培养标本（Ⅱ号菌培养除外）的结果观察处理及报告发放。
岗位Ⅱ：完成仪器的维护、保养和质控工作等。
2.细菌室记录内容明细
2.1 环境条件
室内温度、湿度，每天一次，上午记录。
2.2 恒温设备 2.3
孵箱、普通冰箱，每天一次，上午记录。
2.3 分析仪器
常规每日保养一次，发现问题随时详细记录；质控按要求测试完毕后，及时手工记录。
2.4 标本与结果
不合格标本记录、危急值报告记录、结果记录。
2.5 岗位记录（附表：细菌室岗位记录表）
2.6 其它记录，如交班记录等。
3.细菌室室内环境条件控制范围
温度 18～28℃，湿度 20～80％。

标本采集及保存要求
（微生物室 SOP 之十一）
1 总则：用于细菌培养的标本在收集时应注意严格无菌操作和及时送检，检测后标本应妥善保存。
2.临床标本的采集
2.1 下呼吸道分泌物（痰液）
令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即从下部呼吸道咳出第一口痰，吐在无菌塑料痰盒中，及时送检。
2.2 尿液（中段尿）
护理人员协助采取中段尿约 3ml 入无菌试管中，及时送检。
2.3 粪便：取有粘液、脓血部分的粪便置玻璃大便专用管中，如为稀水便，可直接收集于玻璃管中，及时送检。
2.4 眼、耳、鼻、喉拭子：将棉拭子沾取少许无菌生理盐水（如沾取的太多，可在无菌生理盐水瓶壁上挤去多余的水份），然后采取可疑部位的分泌物，倒悬于无菌试管内,及时送检。
2.5 脓液：用沾有生理盐水的棉拭子沾取脓液，要尽量多取一些，然后将棉拭置于无菌试管中，及时送检。
2.6 血液：
2.6.1 凡怀疑菌血症和败血病的患者，采血培养时，应尽量在未使用抗菌素前采血，如已使用抗菌素，应尽量选择抗菌素在体内浓度最低时采血，应 在病人第二次使用抗菌素之前采集血培养标本。当然在病人发热或寒颤时采集也可。
2.6.2 成人每次采血 5—10ml，小儿采血 2—3ml；
2.6.3 严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定量血液后，无菌注入血培养瓶内，轻轻摇匀，
2.6.4 从抽血到接种入瓶，动作要快，防止血液凝固，同时要及时送检。
2.7 穿刺液：胸腹水、心包液、关节腔液、鞘膜积液：
严格无菌抽取后，注入含肝素抗凝的无菌试管中，轻轻颠倒试管 10 余次，使肝素与穿刺液混匀达到抗凝的目的，或直接无菌注入血培养瓶内及时送检。
2.8 胆汁：由专科医生以无菌方法取引流液 10ml 注入无菌试管。
2.9 脑脊液：以无菌方法取脑脊液 35ml，置无菌试管内，常温保存送检，如只做培养可直接无菌注入血培养瓶内，及时送检。
2.10 生殖器官标本：阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌试管内送检。如疑为淋病奈瑟菌感染，做培养检查时，采集的标本应床旁接种并及时放入孵箱培养。
2.11 烧伤标本：以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌试管中.
2.12 支原体（解脲、人型）培养+药敏的标本采集
2.12.1.支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养基送检。
2.12.2 男性：用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内 2.53cm。
3.临床标本的保存
细菌室标本原则上要求及时送检、及时处理，不得保存。

室内质控失控处理程序
（微生物室 SOP 之十二）
一、BacT/Alert 120 血培养仪室内质控处理程序
1．当 BacT/Alert 120血培养仪质控失败时，仪器会提示你对该瓶孔进行定标，一般定标都能经过，只要定标过了，仪器就能正常工作。
如仪器定标不能经过，就要请厂家工程师对仪器进行检测，并对仪器的有关参数进行调整，直到仪器合格后才能进行日常工作并填写失控报告。
2．每批新购买的试剂必须进行室内质控，当质控结果不能符合要求时，应通知组长协助处理，进行失控原因分析。
2.1 失控的原因分析
2.1.1 自身原因
2.1.1.1 质控菌株、卡片、无菌盐水等出现质量问题。
2.1.1.2 质控菌株不符合所检测卡片的要求。
2.1.1.3 上卡操作中出现问题，如菌液浓度不准等
2.1.1.4 仪器工作是否正常。
2.1.1.5 室温是否符合分析要求。
2.2 失控的处理
2.2.1 操作不规范时应严格按作业指导书重新检测一次。仍失控进行下一步。
2.2.2 检查质控菌株及卡片是否在有效期内，质量如何？无菌盐水是否被污染以及标准菌株是否符合卡片的要求等。在保证质控菌株、卡片、无菌盐水等符合要求的情况下仍失控则进行下一步。
2.2.3 做可能影响检测的仪器相应部分保养，仍失控进行下一步。
2.2.4 请仪器工程师分析，写失控报告。直到质控在控后重新检测。

标本拒收标准
（微生物室 SOP 之十三）
1.支原体培养、鉴定、计数、药敏操作：若送检标本不是运送培养基送检则为不合格标本。
2.找抗酸杆菌：穿刺液标本如发现严重凝固则拒收。
3.脑脊液培养：如标本为非无菌管采集则拒收。
4.中段尿培养：如标本为非无菌管采集则拒收。
5.下呼吸道标本培养：挑取痰标本直接涂片镜检，WBC＜10/LP，上皮细胞＞25/LP 不适合做细菌培养。
6.脓液及创伤分泌物培养：如标本为非无菌管采集则拒收。
7.穿刺液培养：如标本为非无菌管采集则拒收。
8.生殖道分泌物培养：如为淋球菌培养没有直接接种到淋球菌培养基上则拒收。
9.各类培养标本原则上都要求无菌采集并及时送检、及时接种、及时培养，不能保存。
除非特殊情况可置于冰箱保存，对分离怕冷的细菌时，应注意标本的保暖。

温度失控处理措施
（微生物室 SOP 之十四）
1.每天上班记录培养箱、冰箱的温度于温度记录本上，如发现普通培养箱的温度超过37℃（不包括 37℃）或低于 34℃（不包括 34℃）；真菌培养箱温度超过 31℃（不包括31℃）或低于 25℃（不包括 25℃）；冷藏冰箱的温度超过 8℃（不包括 8℃）或低于 2℃（不包括 2℃）；冷 冻冰箱的温度超过10℃（不包括10℃）或 低于30℃（不包括30℃），应立即追溯其失控的时间和原因。
1.1 如失控的原因能够马上纠正（如冰箱断电、冰箱门未关好、温控调节器未正确控制、冰箱严重结霜、温度计损坏等），则由本室人员马上纠正并填写失控报告。
1.2 如冰箱、培养箱本身出现机械故障，本室人员应马上通知维修部或维修商，同时根据排除故障时间的长短是否会对其中的物品质量造成影响而采取相应的措施（ 如把里面的物品转移到能满足需要条件的环境中），并填写失控报告单。
2.培养箱中的培养物应全部拿到工作台，检查培养物的生长情况。
2.1. 如果培养基的菌落生长良好，则按常规程序进行检验。
2.2．如果培养基的菌落生长受抑制，则取标本重新接种，如标本确实无法再次接种，则应与临床医生联系、解释并请医生重新采集标本送检。
2.3．如有细菌生长，则应补做药敏试验，并填写《迟发报告单记录表》，并写明原因。
3.故障处理过程中应及时贴上红色标识，并在温度记录本上用红笔记录失控的温度度数，故障处理后应利用培养箱、冰箱的温度调节器，把温度调回到规定范围的中值，并把专业人员的检查的结果记录在仪器档案袋中。另外还需填写《内部质量控制失控报告单》，当温度再次是失控时，再次记录温度的读数，而且上报负责人。

超净工作台作业指导
（微生物室 SOP 之十五）
1. 目的 规范净化工作台操作与维护工作，确保仪器正常运作。
2. 适用范围：本实验方法适用于微生物检验中净化工作台操作与维护管理。
3. 检验人员职责：负责此仪器操作和维护管理
4. 操作及维护规程
4.1 操作规程
4.1.1 使用工作台时，应提前 50 分钟开机，同时开启紫外杀菌灯，处理操作区内表面积累的微生物，30 分钟后关闭杀菌灯（此时日光灯即开启），启动风机。
4.1.2 对新安装的或长期未使用的工作台，使用前必须对工作台和周围环镜先用超静真空吸尘器或用不产生纤维的工具进行清洁工作，再 采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。
4.1.3 操作区内不允许存放不必要的物品，保持工作区的洁净气流流型不受干扰。
4.1.4 操作区内尽量避免作用明显扰乱气流流型的动作。
4.1.5 操作区的使用温度不能够超过 60℃。
4.2 维护规程及维护方法
4.2.1 根据环境的洁净程度，可定期（一般 2～3 个月）将粗滤布（涤纶无纺布）拆下清洗或给予更换。
4.2.2 定期（一般为一周）对环境周围进行灭菌工作，同时经常见纱布沾酒精或丙酮等有机溶剂将紫外线杀菌灯表面擦干净，保持表面清洁，否则会影响杀菌效果。
4.2.3 当加大风机电压已不能使风速达到 0.32m/s 时必须更换高效空气过滤器。
4.2.4 更换过滤器时，可打开顶盖，更换时应注意过滤器上的箭头标志，箭头指向即为层流气流向。
4.2.5 更换高效过滤器后，应用Y094型尘埃粒子计数器四周边框密封是否良好，调节风机电压，使操作区平均风速保持在0.320.48m/
s范围内，再用 Y094型尘埃粒子计数器检查洁净度。

标本的接种和移种法
（微生物室 SOP 之十五）
接种标本是细菌实验室的一项基本操作技能，目 的是使细菌能得到充分的生长和能分离出单个菌落获得纯培养而供分析鉴定之用，因此作此项技术的操作应按以下方式进行：
1.左手的操作要点：左手负责持平板、试管、烧瓶等物品，操作中，左手应尽量减少摆动，否则，不利于保持物品的无菌状态。
1.1 左手持物品时，最好固定在一个空间方位上，以避免因移动使空气中的细菌进入器皿，造成随机性污染。
1.2 所持的器皿其开口尽量避免向上，持平皿时，能够让平板的表面与地面尽量垂直，试管与器皿烧瓶也可倾斜。当 从标本器皿或平板上挑取接种物或菌落后应立即塞上试管塞或扣上平皿，随即接种标本。
2.右手的操作要点：握有接种工具的右手，将接种环或针沿伸到标本之前应作好接种环或针，镊子等工具的火焰消毒工作，待冷却后才沿伸到标本容器中挑取接种物，在挑取标本后，其接种工具应尽量避免接触试管壁及试管口等。随后将接种物在培养基上分离划线。
3.移种或接种的基本步骤：
3.1 右手持接种工具，在火焰上烧灼 3 次灭菌。
3.2 左手持起标本容器或原代培养物的平皿或试管等。
3.3 用接种工具挑取适量标本或细菌，挑取标本时，应注意选择真实反映感染情况的部分，如粪便挑取粘液脓血部分。纯化细菌应从原代培养物上挑取单个菌落。从液体培养基中取菌，只需将接种环在培养液中蘸取一环即可。
3.4 接种时可根据要求采用不同的接种方法。
3.5 接种后，应在火焰上重复烧灼接种工具并作一定的编号记录，所用工具应放回原处。__