浅论外源性一氧化碳释放分子对脓毒症小鼠肺部炎症反应的抑制作用.docx

浅论外源性一氧化碳释放分子对脓毒症小鼠肺部炎症反应的抑制作用
【摘要】 目的： 研究外源性一氧化碳释放分子(carbon monoxidereleasing molecules2, CORM2)干预对脓毒症小鼠肺部炎症反应的抑制作用。方法: 18只雄性昆明种小鼠随机分为假手术组、CLP模型组和CORM2干预组。制作标准盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)模型,用CORM2进行干预,观察干预前后小鼠肺脏炎症反应的变化情况。分别于CLP术后6 h,12 h,24 h收集血浆、取肺组织,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血浆中肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL1β)炎症因子的表达;检测肺组织中髓过氧化物酶(MPO)活性,观察中性粒细胞的聚集程度;测定肺组织湿干重比(W/D);苏木精伊红(HE)染色观察肺组织病理变化;免疫组织化学法观察细胞间黏附分子(ICAM1)、肺表面活性蛋白A(SPA)的表达。结果: 与假手术组比较,CLP模型组主要表现为肺组织微血管通透性增加,肺泡壁增厚,间质水肿,白细胞浸润,MPO活性明显增强;炎症因子TNFα,IL1β和IL6的表达水平升高();与CLP模型组比较,CORM2干预组肺间质水肿程度减轻,白细胞浸润明显减少,以上炎症因子的表达明显受到抑制()。结论: CDRM2可显着抑制脓毒症机体炎症细胞因子和ICAM1、SPA的表达,降低MPO活性,减少中性粒细胞的聚集,减轻组织炎症反应,对脓毒症小鼠肺部炎症反应有显着的抑制作用。
【关键词】 脓毒症; 肺; 一氧化碳; 炎症反应
　　[Abstract] Objective: To investigate the antiinflammatory effects of carbon monoxidereleasing molecules2(CORM2) to lung inflammation in sepsis mice. Methods: Eighteen male mice were randomly divided into 3 groups:sham group,CLP group and CORM2　make standard cecal ligation and puncture models, exogenous carbon monoxide were　observed the changes in lung inflammation among those groups. After 6 h,12 h and 24 h of CLP operation, the expression of cytokines TNFα and IL1β in plasma samples was detected respectively by ELISA; With their pathological changes of lung tissues observed by hematoxylineosin staining method and their myeloperoxidase activity, neutrophils infiltration in lung tissues detected. Results: Compared with sham group, the permeability of lung tissues in CLP group increased, the alveolar wall turned thick, with interstitial edema and neutrophils infiltrated increasingly; the myeloperoxidase activity and the expression levels of inflammatory factors enhanced , compared with CLP group, the permeability of lung tissues in CORM2 group decreased, the alveolar wall was less thicker, interstitial edema and neutrophils infiltration were all alleviated; the myeloperoxidase activity and the expression levels of inflammatory factors decreased apparently. Conclusion: CORM2 had significant inhibitory effects to lung inflammation in sepsis mice by alleviating the expression levels of inflammatory factors and ICAM1, SPA, and by decreasing the leukocyte sequestration.
　　[Key words] sepsis; lung; carbon monoxide; inflammation
　　脓毒症是由感染引起的系统性炎症反应综合征(system inflammatory response syndrome,SIRS),是严重创(烧)伤、休克、外科大手术后常见的并发症, 进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(multiorgan dysfunction syndrome,MODS),有效地识别、诊治脓毒症的形成与发展是提高临床危重患者救治成功率的重中之重。近年来,对脓毒症的认识已经由既往的感染启动的全身炎症反应发展为由多因素参与的多器官受累的综合征,其中肺脏是最早最易受累的器官[1]。研究结果证实,一氧化碳(CO)是机体内一种重要的化学气体信使,参与了脓毒症引起的氧化应激反应、缺血再灌注损伤、内毒素性休克等病理生理过程,发挥着重要的抗炎、抗凋亡和细胞保护作用。外源性一氧化碳释放分子(carbon monoxidereleasing molecules2, CORM2)是近年合成的一种特殊的CO载体,通过把CO送入到体内,溶解后释放CO发挥生理作用。本文就CORM2对盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)模型小鼠肺部炎症反应的干预作用作一研究。
　　1 材料与方法
　　实验动物分组及处理
　　选用6～8周龄清洁级昆明种小鼠18只,雄性,体质量(20±2)g,由江苏大学动物实验中心提供。实验室适应性饲养1周，术前禁食12 h。随机分为3组:① 假手术组: 氯胺酮100 mg/kg麻醉满意后自腹中线切口,逐层进入腹腔,将盲肠小心取出再放回腹腔,外科缝合伤口; ②CLP模型组: 麻醉同假手术组,打开腹腔后,轻柔快速找出盲肠,提起末端,分离肠系膜,穿细线在盲肠近端结扎,避过系膜血管, 用20号针头穿透结扎处远端,自两穿孔处挤出肠内容物少许,回纳肠管至腹腔。腹膜、肌层一同毯边缝合,皮肤层间断缝合。每只鼠腹腔注射等渗生理盐水 ml抗休克; ③CORM2干预组: 同CLP模型组操作,得标准CLP模型,立即尾静脉注射CORM2(8 mg/kg)。分别于术后6,12,24 h麻醉后留取标本,处死小鼠。
　　主要试剂与仪器
　　CORM2购自美国Sigma公司,使用前用二甲基亚砜(DMSO)溶解。酶联免疫吸附(ELISA) 测定试剂盒购自美国ADL公司,髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)测试盒购自南京建成生物工程研究所,其余试剂均购自美国Sigma公司;低温离心机购自美国Sigma公司,高速低温台式离心机购自美国Beckman公司,Model 680型酶标仪购自美国Bio Rad公司。
　　CORM2配制及应用
　　按照试剂规格,CORM2尾静脉注射(8 mg/kg),即每 mg CORM2溶解于500 μl DMSO中配制成500 μl CORMDMSO溶液。37 ℃温水浸泡小鼠尾巴扩张血管后，吸取8 μl CORMDMSO溶液,溶解于152 μl等渗生理盐水中,每只小鼠自尾静脉注射(160 μl/次),注射完毕棉球压迫止血,计时,标记。
　　动物标本采集
　　分别于CLP术后6,12,24 h氯胺酮麻醉小鼠,打开胸腔,用肝素浸润过的注射器右心室穿刺取血,立即6 500 g离心5 min,收集血浆于-70 ℃保存,待检;分别于6,12,24 h 3个时间点收集各组小鼠肺组织标本,滤纸吸干表面血迹后,迅速放入相应标本袋,-70 ℃保存待检。
　　观察指标及方法
　　肺组织形态学观察 右肺中叶用10 %甲醛固定,常规石蜡切片。进行苏木精伊红(HE)染色,普通光镜下(×400)观察肺组织的肺泡充血、水肿及炎症细胞浸润情况。
　　TNFα和IL1含量测定 用ELISA法测定血浆中TNFα和IL1β含量(具体按试剂盒要求进行)。用酶标仪在波长460 nm 处测定两种细胞因子D值,应用ELISA分析软件计算其含量。
　　MPO活性测定 准确称取肺组织重量100 mg/例,剪碎组织块,与配制好的匀浆介质按重量体积比1∶19匀浆(10 000 r/min、匀浆液1 ml),制备成5%的组织匀浆。检测按照试剂盒说明书进行。
　　肺组织湿干重比测定 剥离左肺,迅速用吸水纸吸干表面水分和血液,电子天平称湿重。置70 ℃烘箱内烘干48 h至恒重,再称重,并计算湿重/干重(W/D)。
　　细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecules1,ICAM1)、肺表面活性蛋白A(surfactant proteinA,SPA)的表达 采用免疫组织化学法观察CORM2干预前后肺组织中两种蛋白表达的变化。
　　统计学分析
　　计量资料均以±s表示,采用SPSS 11. 5 统计分析软件进行单因素方差分析(ANOVA)。为差异有统计学意义。
　　2 结 果
　　肺组织形态学改变
　　假手术组小鼠肺组织小叶结构清晰,肺泡腔干净,肺泡间质无炎性细胞浸润,纤维结缔组织无增生,肺泡壁无增厚,支气管黏膜上皮完整。CLP模型组肺组织充血明显,肺泡间质有炎性浸润,肺泡壁增宽,肺泡腔内可见出血和渗出,并随时间的增加,肺组织病理改变逐渐加重。CORM2干预后肺组织充血程度、肺泡间质炎性浸润及肺泡腔内的出血和渗出明显减轻,肺泡壁水肿程度减轻。结果见图1。
　　血浆中细胞因子TNFα和IL1β的表达
　　在6小时时间点,与假手术组比较,CLP模型组炎症因子TNFα和IL1β表达水平开始升高;与CLP模型组比较,CORM2干预组以上炎症因子的表达受到抑制()。在12小时时间点,与假手术组比较,CLP模型组炎症因子TNFα和IL1β的表达水平进一步升高;与CLP模型组相比较,CORM2干预组以上炎症因子的表达受到抑制(),且抑制作用比6小时组更明显。至24小时的时候,与假手术组比较,CLP模型组依然表现为炎症因子TNFα和IL1β的表达水平升高;与CLP模型组比较,CORM2干预组以上炎症因子的表达受到抑制(),且抑制作用较6小时、12小时更明显。结果见表1。表1 CORM2干预后不同时相血浆细胞因子表达
　　肺组织MPO活性的变化
　　结果表明,较假手术组,CLP术后6,12,24 h,小鼠肺部MPO活性均显着增强,体内应用CORM2干预后,较CLP模型组,MPO 活性均降低。结果见图2。
　　肺组织W/D的变化
　　与假手术组比较,CLP模型组小鼠肺间质水肿明显();用CORM2干预后,水肿程度没有得到明显改善()。结果见表2。表2 小鼠肺组织W/D比较a:与假手术组比较,
　　CORM2干预后肺组织SPA及ICAM1表达的变化
　　与假手术组比较,CLP模型组小鼠ICAM1表达增加;CORM2干预后,ICAM1表达减少;同样,与假手术组比较,CLP模型组小鼠肺泡灌洗液及肺组织中SPA表达减少,说明肺部炎症性损伤的发生、发展可能导致肺泡灌洗液中SPA的降低,而CORM2干预后SPA的表达增加。结果见图3。
　　3 讨 论
　　脓毒症时,机体丧失对感染早期促炎反应的调控而产生系统性全身炎症反应,过度的炎症反应导致组织和弥漫性毛细血管损伤进而导致MODS。作为一种新的金属羰基化合物,CORM2可以通过在生物体内溶解释放一氧化碳,发挥血管活性效应、抗排斥反应及重要的抗炎效应,并且在一定生理剂量时并不提高动物体内碳氧血红蛋白的浓度。
　　肺脏由于其组织疏松,血流丰富,易受细菌感染引起免疫机能紊乱,而成为MODS 的重要靶器官。机体对感染的最初反应是触发形成一种促炎状态，如TNFα，IL1以及血小板活化因子等相继被释放。TNFα,IL1是机体炎症反应早期重要的细胞因子,能诱发脓毒性休克和MODS,是系统性全身炎症反应的重要介质。炎症因子表达增加与组织中白细胞滞留、巨噬细胞被激活密切相关。
　　MPO是主要存在于多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)中的一种酶,其活性常被用以评估炎性组织中PMN的数量和聚集程度,组织中滞留的白细胞参与炎症反应或脓毒症的进展。研究证实,严重烧伤后,CORM2可以作为外源性一氧化碳的供体,明显抑制肝脏中白细胞浸润,抑制促炎症细胞因子的表达,减轻严重烧伤后早期的炎性反应。机体炎症反应综合征阶段,伴随着重要器官系统白细胞的滞留,细胞或组织发生氧化性损伤,在肺组织表现为肺泡腔内的出血和渗出,肺泡间质炎性浸润及肺泡壁增宽等病理改变,引起白细胞被激活、血管损伤和系统炎症反应的进一步发展。本实验探讨了CORM2干预对CLP术后小鼠肺组织中白细胞滞留动态的过程及炎症反应发生发展的效应。CORM2干预后,MPO 活性显着降低。表明CORM2可有效阻止CLP后小鼠肺部PMN的趋化和浸润,最终减少氧化产物的生成和组织氧化性损伤。同时表明,它至少会部分抑制局部组织促炎因子的活化和释放,这一过程可能和肺部白细胞滞留减少有关。但是,CORM2不能降低肺微循环的通透性。具体原因尚未明确,推测可能的原因是在整个试验过程中,难以保持CORM2在一个有效的浓度。因此,我们预测，进一步研究在高浓度氧气(98%)吸入下,利用CORM2较长时间干预,可能会显着改善CLP术后小鼠肺部损伤状况。
　　大量黏附分子ICAM1的表达被认为是烧伤后炎症机体白细胞滞留的直接原因。ICAM1激活白细胞和内皮细胞,转而促进各种炎症因子的释放,导致系统炎症反应综合征、急性呼吸窘迫综合征和多器官功能障碍综合征。白细胞和内皮细胞的激活引起体内白细胞、血小板和红细胞的聚集,也可能促进弥散性血管内凝血和多器官功能衰竭的进一步发展。这也充分说明了脓毒症肺脏损伤的持续性与严重性。因此,研究脓毒症小鼠肺脏中ICAM1的表达将为探讨CORM2干预脓毒症的部分机理提供明确的指导。SPA是肺组织中最主要的蛋白成分, 肺部炎症性损伤患者病情的发生、发展与肺泡灌洗液中SPA的降低有关。SPA主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞及肠上皮clara细胞分泌,具有参与局部防御、调节局部免疫和炎症及减轻肺缺血再灌注损伤等重要作用。本实验通过对CORM2干预前后SPA蛋白水平的变化,分析得出CORM2对炎症过程中肺功能的影响。
　　目前,已知NFκB是一种可以在免疫反应和炎症反应中快速启动的转录因子,它通过调控细胞因子、趋化因子、细胞间黏附分子及生长因子的表达而在免疫和炎症反应中发挥作用。今后,我们将侧重于从IKKβ激酶激活、IκB 降解、NFκB 活化最终引起TNFα合成这一信号通路研究CORM2的作用靶点,阐明CORM2在减轻机体肺部炎症反应方面的分子机制。
　　(本文图1，图3见彩色插图)
【参考文献】
　　[1] Kepros JP, Gauvin JM, Reed DN Jr,et al. Acute lung injury: an indicator of serious systemic illness[J]. Curr Surg,2006,63(3):197-201.
　　Liu DM, Sun BW, Sun ZW, et　of inflammatory cytokine production and oxidative stress by COreleasing moleculesliberated CO in the small intestine of thermallyinjured mice [J].Acta Pharmacol Sin,2008，29(7):838-846.
　　Daniel R, Markus S, Michael A, et　of experimental sepsis by cecal ligation and puncture [J].Nat Protoc,2009,4(1):31-36.
　　任成山.脓毒症的发病机制[J].中国急救医学, 2005, 25(10):748-750.
　　Sun BW, Chen ZY, Chen X, et al. Attenuation of leukocytes sequestration by carbon monoxidereleasing molecules: liberated carbon monoxide in the liver of thermally injured mice[J]. J Burn Care Res, 2007, 28(1):173-181.
　　Sun BW, Sun H,Liu C,et al. Role of COreleasing molecules liberated CO in attenuating leukocytes sequestration and inflammatory responses in the lung of thermally injured mice [J].J Surg Res,2007,139(1):128-135.
　　孙炳伟, 陈 曦, Kazuhiro Katada, et al.外源性一氧化碳释放分子抑制脓毒症炎症反应的实验研究[J].江苏大学学报:医学版,2008,18(5):369-377.
　　Cheng IW,Ware LB,Greene KE,et　value of surfactant proteins A and D in patients with acute lung injury[J]. Crit Care Med,2003,31(1):20-27.
　　Sun B, Sun Z, Jin Q, et al. COreleasing molecules (CORM2)liberated CO attenuates leukocytes infiltration in the renal tissue of thermally injured mice[J]. Int J Biol Sci,2008, 4(3):176-183.