四嗪二甲酰胺体外诱导NB4细胞增殖、凋亡与分化作用的研究.docx
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1、四嗪二甲酰胺体外诱导NB4细胞增殖、凋亡与分化作用的研究【摘要】 为了观察四嗪二甲酰胺是一种咪唑四嗪类口服抗肿瘤药,属于不对称四嗪类化合物。四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1)是一种新颖的对称四嗪化合物,是胡维孝等1,2改进了合成方法而设计并合成的经结构多种修饰的3,6-二甲基-1,4二氢-1,2,4,5-四嗪类化合物。经药物构效学筛选,其中ZGDHu-1具有较强的抗肿瘤作用3,有望成为一种具有自主知识产权的抗癌新药。为了研究ZGDHu-1抗血液肿瘤的作用及其作用途径,我们以急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4为模型,体外观察了ZGDHu-1对NB4增殖、分化和凋亡的作用,并探讨其作用的分子机制。材料和
2、方法材料ZGDHu-1由浙江工业大学药学院制药工程研究所合成,系白色片状结晶。用二甲亚砜溶解配制贮存液,浓度为1 mg/ml,应用液用含10%的小牛血清的RPMI 1640配制。二甲亚砜、噻唑蓝、蛋白酶K、TPA、全反式维甲酸为Sigma公司产品;NBT购自Fluck公司 ;DNA-Prepkit(内含透膜剂,RNase和PI)为美国Beckman-Coulter公司产品; Annexin-和PI试剂系Bender MedSystems公司产品;bcl-2单克隆抗体,bax单克隆抗体及用于bcl-2、bax检测的透膜剂、 CD11b、CD13及同型对照均系法国Immunotech公司产品。Ho
3、echst33258试剂系CalBiochem公司产品。PE标记的磷酸化P38MAPK单克隆抗体和磷酸化STAT3单克隆抗体购自Bioscience公司;hTERT-mRNA实时荧光定量PCR试剂盒由Roche公司提供。细胞培养NB4细胞株引自浙江大学血液病研究所。采用含10%的小牛血清的RPMI 1640并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸及青霉素和链霉素(100 g/ml)的培养体系培养。培养环境为37、5%的CO2培养箱。取对数生长期的细胞进行实验。细胞活率、细胞计数和形态观察以2105/ml的细胞浓度,分别接种于含9种浓度不同的ZGDHu-1的培养液中,并设10 g/ml的ATRA作为阳性对照组和
4、不加药物的空白对照组,每瓶含5 ml。培养24、48和72小时,计数各组细胞数,计算细胞增殖抑制率,用4%台盼蓝染色,计数活细胞数。每次每瓶计数3次,实验重复3次,绘制细胞增殖和活力曲线。取药物作用后各组的细胞先在倒置显微镜下观察,再将细胞悬液离心涂片,用Wright-Giemsa染色,光镜下观察细胞形态变化。ZGDHu-1对NB4细胞生长影响的MTT测定调整细胞浓度为5104/ml,接种于96孔无菌培养板中,每孔200 l。实验组、阳性对照组和空白组的设置同细胞活率和计数测定。每组每个浓度下设3个复孔,实验重复3次。培养24、48和72小时后用MTT法读取吸光度值,计算抑制率并绘制剂量效应曲
5、线,求出ZGDHu-1对NB4细胞的半数抑制浓度(IC50)。凋亡细胞的Annexin V/PI标记染色测定调整细胞浓度2105/ml的,分别接种于含6种不同ZGDHu-1浓度的培养液中,并设10 g/ml的ATRA作为阳性对照组和不加药物的空白对照组,每瓶含5 ml。培养12小时后轻轻收获细胞1106个,用冷PBS洗1遍后置0水浴中,加490 l结合缓冲液,轻轻混匀后加5 l FITC-Annexin V和5 l PI,10分钟后用流式细胞仪检测。细胞周期和DNA倍体分析分组方法同Annexin V/PI标记,培养48小时后,取培养细胞悬液 ml,用冷PBS各洗涤1次,加DNA-Prepki
6、t中透膜液50 l,轻摇后放置1分钟,加碘化丙锭染液500 l作用15分钟后,在EPICS-XL型流式细胞仪上分析,检测104以上个细胞,并用Muticycle 软件进行DNA倍体及细胞周期分析,计算亚二倍体峰 (subG1)的百分率。DNA琼脂糖凝胶电泳收获经ZGDHu-1作用48小时的NB4细胞1107个,用SDS和蛋白酶K裂解细胞后,按照常规方法用酚一氯仿提取DNA,复溶于TE缓冲液中,经溴乙锭染色后,用15 g/L琼脂糖凝胶电泳,5 V/cm,电泳3-4小时,在紫外线透射仪上显影拍照。NBT还原试验取经ZGDHu-1作用后的NB4细胞500 l,与2 g/L的NBT溶液混合,加入100
7、 g/ml TPA 10 l,37孵育30分钟后离心涂片,光学显微镜下观察胞浆内含蓝灰色颗粒的阳性细胞。计数200个细胞,得出NBT阳性细胞的百分率。细胞表面分化抗原检测取经药物作用后的细胞,用PBS洗涤1次后,调整细胞浓度为106/ml,用CD11b、CD13单克隆抗体对各组细胞进行免疫标记,用流式细胞仪检测细胞CD11b、CD13的抗原表达。bcl-2、bax基因的表达分析收集药物作用的细胞,用PBS洗涤1次后调整细胞悬液浓度为5106/ml,细胞悬液再用PBS洗涤,每管加100 l细胞悬液,加透膜剂I 100 l,室温放置15分钟后用PBS洗1遍,再加透膜剂 100 l,轻摇。5分钟后各
8、加bcl-2、bax和同型对照20 l,室温放置20分钟后用PBS洗2次,加PE标记的第二抗体,室温暗处放置20分钟后用PBS洗1次,将细胞悬于 ml PBSF中。用流式细胞仪检测阳性细胞百分率。hTERT-mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR法检测收集经ZGDHu-1作用的NB4细胞,以TRIZOL一步法按照说明书提取各组细胞的总RNA。检测时设加逆转录酶的测定管、不加逆转录酶的空白管和以PBGD为内参照的对照管。每批检测时同时测定hTERT-mRNR和PBGD的阴的、阳性对照及标准曲线。PCR反应体系为20 l,内含有10反应缓冲液2 l,逆转录酶 l,10hTERT或PBGD反应测定应
9、液2 l,PCR级蒸馏水 l,RNA提取物2 l。按试剂盒说明书在LightCycler荧光PCR仪上设置反应程序。结果以/内对照管的比值表示。磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3表达的检测收集经ZGDHu-1处理后的NB4细胞,用PBS洗1次,并调整细胞浓度约为106/ml。用2%多聚甲醛/PBS溶液于37固定10分钟,离心后弃上层液;用90%的甲醇作细胞透膜,冰浴30分钟;再用PBS洗细胞2次。经上述处理后的细胞悬液各100 l分别用PE标记的磷酸化P38MAPK单克隆抗体和磷酸化STAT3单克隆抗体20 l染色,室温避光放置60分钟后在流式细胞仪上分析。统计学分析实验数据用均数标准差表
10、示,采用SPSS ,for windows统计软件,作F检验比较。结果ZGDHu-1对NB4细胞增殖及活力的影响不同浓度的ZGDHu-1对NB4细胞的增殖均有抑制作用,呈现剂量-时间依赖关系。表1说明50 ng/ml的ZGDHu-1即可显着抑制NB4细胞的生长。 48和72小时的IC50分别为450和200 ng/ml。NB4细胞经ZGDHu-1作用后,随着作用剂量和时间的增加,细胞增殖明显受抑,细胞活率显着减少,呈现剂量和时间的量效关系。Table 1. Effect of ZGDHU-1 on proliferation of NB4 cellsZGDHu-1对NB4细胞诱导分化作用细胞形
11、态学观察NB4细胞经50 ng/ml ZGDHu-1作用3天后,光学显微镜下显示细胞开始发生分化,表现为细胞体积缩小,细胞核也明显缩小,核仁消失,染色质缩增粗,胞浆增多,出现少量颗粒,核浆比例缩小,核偏于一侧,有凹陷和分叶(图3)。NBT试验NB4细胞与2、10、50、100 ng/ml ZGDHu-1共同培养3天后,NBT的还原率随药物浓度递升而增加,各实验组和ATRA对照组结果均显着高于空白对照组。Table 2. Results of NBT and CD11b, CD13 of NB4 cells after treatment with different concentration
12、s of ZGDHU-1细胞表面分化抗原的改变NB4细胞与 ZGDHu-1共同培养3天后,细胞表面分化抗原检测显示,CD11b和CD13的表达明显高于空白对照组,提示ZGDHu-1能诱导NB4细胞向成熟细胞分化。ZGDHu-1对NB4细胞的诱导凋亡作用细胞形态学观察倒置显微镜下,空白对照组NB4细胞形态均一,可成簇生长。经ZGDHu-处理的NB4细胞皱缩变小,大小不一,出现细胞碎裂,未见细胞成簇生长 。经Wright-Giemsa染色后油镜下观察,细胞形态出现核固缩、核边聚、核碎裂,胞膜出泡,并可见典型的凋亡小体等。经Hoechst33258荧光染色后,在荧光显微镜下凋亡细胞可见细胞核或细胞质
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