内毒素13β葡聚糖和降钙素检测的临床应用.pptx

内毒素、1，3-葡聚糖和降钙素原检测的临床应用安徽省立医院 检验科戴媛媛内毒素概述 内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖（构中的脂多糖（LPS），这些成分只），这些成分只在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或活菌以发泡形式将其释出。活菌以发泡形式将其释出。外层外层菌体多糖（菌体多糖（O抗原）抗原），与细菌侵袭力有，与细菌侵袭力有关。关。中层中层同一种属之间是相同一种属之间是相同的。同的。内层内层特殊的糖磷脂，起特殊的糖磷脂，起毒性作用，而无种毒性作用，而无种属特异性。属特异性。特异性多糖特异性多糖核心多糖核心多糖类脂类脂A内毒素的结构发热反应发热反应1激活血管活性物质的释放激活血管活性物质的释放2激活凝血和纤溶系统激活凝血和纤溶系统3内毒素的生物学活性直接或间接损害肝脏直接或间接损害肝脏5激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统6内毒素的生物学活性激活补体激活补体4内毒素的有益作用增加机体非特异性免疫力增加机体非特异性免疫力1防御放射性损伤，促进粒细胞生成防御放射性损伤，促进粒细胞生成2增加网状内皮系统功能增加网状内皮系统功能3抗肿瘤，免疫佐剂作用抗肿瘤，免疫佐剂作用4内源性内源性内毒素血症内毒素血症外源性外源性内毒素血症产生原因肠道内毒素的吸收肠道内毒素的吸收1败血症时血中细菌的释放败血症时血中细菌的释放23有效的抗菌治疗后，细菌崩解有效的抗菌治疗后，细菌崩解输入了含有输入了含有细菌的药物、细菌的药物、血液或者体血液或者体液等。液等。内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、缺氧及酸中毒等。缺氧及酸中毒等。内毒素血症的临床症状最严重的后果：致最严重的后果：致死性感染性休克，死性感染性休克，多器官功能衰竭，多器官功能衰竭，DIC等。病死率极等。病死率极高。高。肺炎肺炎100%、尿路感染、尿路感染70-80%、腹腔感、腹腔感染染72-84%、烧伤、烧伤85%、急性胰腺炎、急性胰腺炎90%、败、败血症血症70%、急性肝炎、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎、暴发性肝炎58-100%、丙肝、丙肝61.54%、胆石症伴急性梗阻、胆石症伴急性梗阻性化脓性感染性化脓性感染85%、多器官功能衰竭、多器官功能衰竭100%。各类疾病内毒素血症的发生率内毒素检测的临床应用在肝胆疾病中的应用在肝胆疾病中的应用1在呼吸系统感染中的应用在呼吸系统感染中的应用2在胰腺疾病中的应用在胰腺疾病中的应用3在溃疡性结肠炎中的应用在溃疡性结肠炎中的应用4在全身性细菌感染中的应用在全身性细菌感染中的应用5在不明原因发热中的应用在不明原因发热中的应用6内毒素检测在医院中的应用在医院灭菌制剂检验中应用在医院灭菌制剂检验中应用1对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测2在透析站和血站中的应用在透析站和血站中的应用3在临床医学研究中的应用在临床医学研究中的应用4鲎试验是鲎试验是19681968年由年由LevinLevin和和BangBang建立。建立。其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断试品素产生凝集反应的现象，作为判断试品中细菌内毒素含量的一种方法。中细菌内毒素含量的一种方法。内毒素的检测方法内毒素的检测方法背面观背面观 就像是古代武士的心甲就像是古代武士的心甲腹面观腹面观腹部基本呈六角形，腹部基本呈六角形，还可以看到它发达的附肢还可以看到它发达的附肢 内毒素的检测原理内毒素的检测原理GG内毒素的检测方法内毒素的检测方法 鲎试剂（鲎试剂（Limulus amebocyte lysate LAL)凝胶法凝胶法0.03EU/ml范围内半定量范围内半定量1浊度法浊度法0.006-300EU/ml,检测范围大检测范围大2比色法比色法0.006-15EU/ml范围内定量范围内定量3ELISA0.1pg/ml4流式细胞术流式细胞术测内毒素的量而不是活性测内毒素的量而不是活性5化学发光测定法化学发光测定法6内毒素检测的参考值 10pg/ml以下以下 ：健康人值健康人值 10-20pg/ml ：病变观察期病变观察期 大于大于20pg/ml ：内毒素血症内毒素血症 肝炎肝炎 败血症败血症 肿瘤肿瘤 内毒素浓度内毒素浓度 50-320 20-1000 20-700 (1-3)-D-葡聚糖葡聚糖侵袭性真菌感染的定义定义定义定义定义:指致病性真菌侵犯皮指致病性真菌侵犯皮指致病性真菌侵犯皮指致病性真菌侵犯皮 下组织、黏膜、肌肉和下组织、黏膜、肌肉和下组织、黏膜、肌肉和下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真内脏器官等所引起的真内脏器官等所引起的真内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性菌感染性疾病，危害性菌感染性疾病，危害性菌感染性疾病，危害性较大。较大。较大。较大。条件致病性真菌条件致病性真菌条件致病性真菌条件致病性真菌念珠菌属念珠菌属念珠菌属念珠菌属曲霉属曲霉属曲霉属曲霉属其他其他其他其他侵袭性真菌感染的特点1.1.不产生内毒不产生内毒不产生内毒不产生内毒 素和外毒素素和外毒素素和外毒素素和外毒素 致病机理不明致病机理不明致病机理不明致病机理不明4.4.早期症状无特异性，早期症状无特异性，早期症状无特异性，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病往往被原发病掩盖，病往往被原发病掩盖，病往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡程长，发现较晚，死亡程长，发现较晚，死亡程长，发现较晚，死亡率高率高率高率高2.2.致病力一般致病力一般致病力一般致病力一般 较弱，机体免较弱，机体免较弱，机体免较弱，机体免 疫低下时发生疫低下时发生疫低下时发生疫低下时发生3.3.感染菌种变化，感染菌种变化，感染菌种变化，感染菌种变化，白色念珠菌感染下白色念珠菌感染下白色念珠菌感染下白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增降，曲霉菌感染增降，曲霉菌感染增降，曲霉菌感染增长趋势上升明显长趋势上升明显长趋势上升明显长趋势上升明显1.1.内源性诱因内源性诱因2.2.外源性诱因外源性诱因影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等l l 广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂；广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂；广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂；广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂；l l 插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；l l 免疫缺陷综合症免疫缺陷综合症免疫缺陷综合症免疫缺陷综合症侵袭性真菌感染的诱因侵袭性真菌感染（IFI）现状I I I IF F F FI I I I诊诊诊诊断断断断困困困困难难难难及及及及漏漏漏漏诊诊诊诊情情情情况况况况严严严严重重重重I IF FI I发发发发生生生生率率率率不不不不断断断断增增增增加加加加IFIIFI感染病死率很高感染病死率很高感染病死率很高感染病死率很高123国内侵袭性真菌感染不容忽视国内侵袭性真菌感染不容忽视刘正印等，中华医学杂志2003,83(5):399-402感染人数感染人数感染人数感染人数国内侵袭性真菌感染不容忽视国内侵袭性真菌感染不容忽视临床药物治疗杂志 2007年第5卷第1期 感染率感染率感染率感染率(%)(%)中国感染与化疗杂志2008 年7 月20 日第 8 卷第4 期l 尸检研究发现，尸检研究发现，75%的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊l 诊断困难的主要原因诊断困难的主要原因：-临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖-确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者的病情所限难以实施的病情所限难以实施-真菌检测项目开展相对不足或滞后真菌检测项目开展相对不足或滞后IFIIFI诊断困难及漏诊情况严重诊断困难及漏诊情况严重主要可引发侵袭性真菌感染的疾病肺炎肺炎肺纤维肺纤维症症脑出血脑出血脑梗塞脑梗塞硬膜下血硬膜下血瘤术后瘤术后胸部大动胸部大动脉瘤术后脉瘤术后糖尿病糖尿病再生障碍再生障碍性贫血性贫血MODSDIC胃癌，肝胃癌，肝癌，肝内癌，肝内胆管癌，胆管癌，肺癌，多肺癌，多发性骨髓发性骨髓瘤，白血瘤，白血病，恶性病，恶性淋巴瘤淋巴瘤肺结核肺结核腹腔内脓腹腔内脓肿肿AIDS呼吸系统呼吸系统呼吸系统呼吸系统疾病疾病疾病疾病感染症及感染症及感染症及感染症及寄生虫病寄生虫病寄生虫病寄生虫病循环系统循环系统循环系统循环系统疾病疾病疾病疾病内分泌内分泌内分泌内分泌疾病疾病疾病疾病血液及造血血液及造血血液及造血血液及造血器官疾病器官疾病器官疾病器官疾病肿瘤类肿瘤类肿瘤类肿瘤类侵袭性真菌感染侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection,IFI)的发病的发病率率逐年上升逐年上升,其中又以其中又以侵袭性肺部真菌感染侵袭性肺部真菌感染(invasivepulmonaryfungalinfection,IPFI)最常见最常见,大约占大约占50%60%。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可病死率可高达高达30%80%。侵袭性肺部真菌感染侵袭性肺部真菌感染l临床表现临床表现：缺乏特异性缺乏特异性,多表现为发热、咳多表现为发热、咳嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。l 现现 状状：两高两低一快两高两低一快检测方法相对滞后检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的副作用小的 新型抗真菌药物价格昂贵新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高。导致病死率高。高院内感染率和病死率高院内感染率和病死率低临床和实验室诊断率低临床和实验室诊断率 患者病情恶化快患者病情恶化快侵袭性肺部真菌感染侵袭性肺部真菌感染死亡率死亡率死亡率死亡率(%)(%)诊断延迟诊断延迟诊断延迟诊断延迟时间时间时间时间(h)(h)ICUICU诊断延迟时间与死亡率的关系诊断延迟时间与死亡率的关系111133333030353510101010151515152020202025252525303030303535353512 h12 h12 h12 h12-24 h12-24 h12-24 h12-24 h 24-48 h24-48 h24-48 h24-48 h48 h48 h48 h48 hMorrell M et al.Antimicrob Agents Chemother 2005,49:36403645.美国四大医疗中心做的一项回顾性研究美国四大医疗中心做的一项回顾性研究死亡率死亡率死亡率死亡率(%)(%)诊断延迟时间诊断延迟时间诊断延迟时间诊断延迟时间(d)(d)Garey KW et al.Clin Infect Dis 2006,43:2531.b1,6葡聚糖 磷脂双分子层几丁质麦角固醇b1,3葡聚糖合成酶mannoproteins1,3真菌细胞膜、壁结构真菌细胞膜、壁结构羊毛固醇羊毛固醇C C1414去甲基化酶去甲基化酶1414位还原和位还原和7 78 8位异构酶位异构酶角鲨烯环氧化酶角鲨烯环氧化酶1-3-D-葡聚糖本质及特点真菌细胞壁成分，占真菌细胞壁成分，占50%以上以上1其他微生物、动物及人的细胞不含该成分其他微生物、动物及人的细胞不含该成分2用于侵袭性真菌感染的早期诊断用于侵袭性真菌感染的早期诊断3(1-3)-D-葡聚糖特性1.2.3.对热极为稳定，高压对热极为稳定，高压对热极为稳定，高压对热极为稳定，高压121121并不能使其灭活。并不能使其灭活。并不能使其灭活。并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞在念珠菌和曲霉菌细胞在念珠菌和曲霉菌细胞在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对壁中含量较多，对壁中含量较多，对壁中含量较多，对GG试验灵敏试验灵敏试验灵敏试验灵敏。当真菌进入人体血当真菌进入人体血当真菌进入人体血当真菌进入人体血液或深部组织后，液或深部组织后，液或深部组织后，液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、经吞噬细胞的吞噬、经吞噬细胞的吞噬、经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，消化等处理后，消化等处理后，消化等处理后，(1-(1-3)-D-3)-D-葡聚糖可从葡聚糖可从葡聚糖可从葡聚糖可从胞壁中释放出来，胞壁中释放出来，胞壁中释放出来，胞壁中释放出来，从而使血液及其它从而使血液及其它从而使血液及其它从而使血液及其它体液中含量增高。体液中含量增高。体液中含量增高。体液中含量增高。当真菌在体内含量当真菌在体内含量当真菌在体内含量当真菌在体内含量减少时，机体免疫减少时，机体免疫减少时，机体免疫减少时，机体免疫系统可将其清除。系统可将其清除。系统可将其清除。系统可将其清除。在浅部真菌感染在浅部真菌感染在浅部真菌感染在浅部真菌感染中，中，中，中，(1-3)-D-(1-3)-D-葡聚糖未被释放葡聚糖未被释放葡聚糖未被释放葡聚糖未被释放出来，故其在体出来，故其在体出来，故其在体出来，故其在体液中的量不增高。液中的量不增高。液中的量不增高。液中的量不增高。“G”试验缘何而来？试验缘何而来？pp1-3-D1-3-D1-3-D1-3-D-葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的物中的物中的物中的GG因子，引起裂解物凝固，故称因子，引起裂解物凝固，故称因子，引起裂解物凝固，故称因子，引起裂解物凝固，故称GG试验。试验。试验。试验。（1-31-3）-D-Glucan-D-GlucanLAL-RM(LAL-RM(反应物反应物反应物反应物)GG因子因子因子因子活化活化活化活化GG因子因子因子因子凝固酶原凝固酶原凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶凝固酶凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）试验反应机理图：试验反应机理图：试验反应机理图：试验反应机理图：内毒素与-葡聚糖的检测比较葡聚糖的检测比较已知能与鲎试剂发生反应的物质有已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和细菌内毒素和-葡聚糖，但它们葡聚糖，但它们的反应曲线不一样。内毒素反应曲的反应曲线不一样。内毒素反应曲线为线为S型特征曲线，而型特征曲线，而-葡聚糖反葡聚糖反应曲线为经过应曲线为经过0点的斜线。点的斜线。内毒素和内毒素和-葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线观察期不确定，费时费力，特观察期不确定，费时费力，特征性不明显并对医师的专业水征性不明显并对医师的专业水平要求高平要求高辅助方法：临床表现，免疫学，病辅助方法：临床表现，免疫学，病理学，影像学检查等理学，影像学检查等用于实验室检测，已成为这一用于实验室检测，已成为这一领域研究的热点领域研究的热点3.PCR3.PCR技术：技术：真菌的抗原、抗体及代真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检谢产物的血清学检查和真菌核酸检测测对儿童及接受造血干细胞移植对儿童及接受造血干细胞移植患者、患者、ICUICU患者不适用患者不适用 2.GM2.GM试验：试验：曲霉属半乳甘露聚糖抗曲霉属半乳甘露聚糖抗原检测。判断是否曲霉属真菌感染原检测。判断是否曲霉属真菌感染耗时短，灵敏度高，特异性强，耗时短，灵敏度高，特异性强，定量检测可判断感染严重程度定量检测可判断感染严重程度1.G1.G试验：试验：通过检测通过检测(1-3)-D-(1-3)-D-葡葡聚糖的含量，判断是否有真菌感染聚糖的含量，判断是否有真菌感染非传非传统统检查检查敏感性低，耗时长敏感性低，耗时长,培养阳性培养阳性率低。培养结果是定性的，有率低。培养结果是定性的，有些标本采集困难些标本采集困难直接培养真菌法直接培养真菌法传传 统统检检 查查特特特特 点点点点方方方方 法法法法侵袭性真菌感染的临床检测方法对比侵袭性真菌感染的临床检测方法对比 D D葡聚糖的评价葡聚糖的评价l l可检测多种致病真菌感染可检测多种致病真菌感染可检测多种致病真菌感染可检测多种致病真菌感染 念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌，念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌，念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌，念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌，毛孢子菌等毛孢子菌等毛孢子菌等毛孢子菌等l l不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等）不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等）不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等）不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等）l敏感性、特异性：敏感性、特异性：9090左右左右 对于念珠菌血症对于念珠菌血症对于念珠菌血症对于念珠菌血症,G,G,G,G试验检测是首选检查试验检测是首选检查试验检测是首选检查试验检测是首选检查J.Clin.Microbiol.2008.46:10091013.BG值在值在IFI临床表现出现之前就已经高于正常值临床表现出现之前就已经高于正常值u Pazos等报道等报道5例确诊例确诊IFI及及3例临床诊断的例临床诊断的IFI患者，发现患者，发现BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部HRCT检检查发现以前查发现以前。平均早于发热平均早于发热5d早于呼吸道症状平均早于呼吸道症状平均10.7d J Clin Microbiol，2005，43(1)：299305G G试验检测评价试验检测评价uOdabasi等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为期期3周每周周每周2次采血检测及临床观察次采血检测及临床观察发现：发现：BG值开始高于值开始高于60pgml的时间比最后的时间比最后确诊为确诊为IFI或临床诊断或临床诊断IFI平均提前了平均提前了10d Clin Infect Dis，2004，39(2)：199205G G试验检测评价试验检测评价 D D葡聚糖参考值葡聚糖参考值p健康人：健康人：20 pg/ml关于关于G G试验试验建议建议G试验临床应用试验临床应用 1明确诊断明确诊断（抗真菌药物治疗前）（抗真菌药物治疗前）2治疗效果监测治疗效果监测（抗真菌药物治疗后）（抗真菌药物治疗后）3连续连续2次采血进行次采血进行G试验试验临床临床细菌内毒素及细菌内毒素及(1-3)-(1-3)-D-Glucan-D-Glucan检测的国内外发展检测的国内外发展p国国外外：血血液液（包包括括血血浆浆、脑脑脊脊液液、血血清清、腹腹水水液液、尿尿液液、唾唾液液、乳乳汁汁等等）中中内内毒毒素素以以及及(1-3)-(1-3)-D-Glucan-D-Glucan微微量量定定量量检检测测已已经经成成为为现现实实，目目前前在在美美国国、日日本本等等国国均均已已出出现现专专用用细细菌菌内内毒毒素素及及(1-3)-(1-3)-D-Glucan-D-Glucan检检测测仪仪器器及及配配套套的的检检测测试试剂剂盒盒，而而且且获获得得FDAFDA及及厚厚生生省省批批准准文文号号，作作为为一一种种日日常常检检测项目。测项目。p国国内内：MB-80 检检测测系系统统，为为国国内内独独家家研研制制和和生生产产的的检检测测临临床床内内毒毒素素及及(1-3)-(1-3)-D-Glucan-D-Glucan的的专专用用仪仪器器，同同时时具具有有配配套套的的检检测测试试剂剂盒盒 EKT-5Mset and GKT-%M set获获得得SDASDA批批准文号准文号,降钙素原生化结构和生物合成生化结构和生物合成1生物来源生物来源2降钙素原概述 116个氨基酸组成，相对分子量为13 KD的糖蛋白。在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网合成。人血清PCT含量极低，约00025 g/L。当发生严重细菌感染和败血症时，其浓度可增高10000倍。在甲状腺切除后严重感染患者血中PCT的浓度仍升高，推测各种器官中的巨噬细胞和单核细胞可能是败血症时PCT的来源。PCT的半衰期大约为2024 h。PCT的清除途径尚不完全清楚。它很少经肾脏排出。因此血浆PCT检测也适用于肾衰或人工肾治疗的患者。代谢代谢3降钙素原概述PCT的临床应用特点高敏感性和特异性高敏感性和特异性1出现时间早出现时间早2半衰期短半衰期短3不受机体免疫状态的影响不受机体免疫状态的影响4PCT的临床应用特点可鉴别诊断全身与局部细菌性感染可鉴别诊断全身与局部细菌性感染5可诊断良恶性肿瘤是否有继发感染可诊断良恶性肿瘤是否有继发感染6鉴别诊断新生儿败血症及败血症休克鉴别诊断新生儿败血症及败血症休克7可判断是呼吸道感染是否使用抗生素可判断是呼吸道感染是否使用抗生素8PCT的检测方法凝胶层析法和高效液相色谱法凝胶层析法和高效液相色谱法1酶免法和放免法酶免法和放免法2金标法金标法3免疫荧光法免疫荧光法4总 结 PCT是一项快捷、有效的常规实验指标，可帮助临床诊断、疗效观察与指导用药。