单核细胞增生性李斯特菌分子生物学检测技术的研究进展.pdf

Science and Technology of Food Industry专 题 综 述2014年第4期单核细胞增生性李斯特菌分子生物学检测技术的研究进展冯可1，2，胡文忠2，*，姜爱丽2，徐永平1，萨仁高娃2（1.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116024；2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116600）摘要：单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是主要食源性致病菌之一，可引起李斯特菌病，感染严重者会出现致死现象。传统的单增李斯特菌检测方法耗时长，步骤繁琐。因此，特异性强，高效性以及简便的检测手段已成为研究热点。本文综述了运用分子生物学手段对单核细胞增生性李斯特菌检测的研究概况，并对该技术未来发展趋势进行了展望。关键词：单核细胞增生性李斯特菌，PCR，Real-time PCR，基因芯片，检测技术Research progress in molecular biology detection methods ofListeria monocytogenesFENG Ke1，2，HU Wen-zhong2，*，JIANG Ai-li2，Xu Yong-ping1，SA-ren-gao-wa2（1.College of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）Abstract：Listeria monocytogenes was one of the most frequent causes of death as food-borne pathogens infood.Traditional methods to detect Listeria monocytogenes are time-consuming and complex.Therefore，thehigh specificity，high efficiency and simple detection methods have become a research direction.This papersummarized molecular biology methods of the detection for Listeria monocytogenes and prospect thedevelopment direction of this field.Key words：Listeria monocytogenes；PCR；real-time PCR；DNA microarray；detection中图分类号：TS201.3文献标识码：A文 章 编 号：1002-0306（2014）04-0392-05收稿日期：20130814*通讯联系人作者简介：冯可（1985），男，博士，研究方向：食源性致病菌检测。基金项目：国家科技支撑计划项目（2012BAD38B05）；国家自然科学基金项目（31172009）；大连市科技计划项目（2012E13SF106）；大连市金州新区科技计划项目（2012-A1-049）。李斯特氏菌（Listeria）是一种典型的胞内寄生革兰氏阳性短杆菌，共分7个种。包括产单核细胞增生性李斯特氏菌（L.monocytogenes，LM）、伊氏李斯特菌（L.ivanovii）、无害李斯特菌（L.innocua，又名英洛克李斯特菌）、韦氏李斯特菌（L.welshmei）、西尔李斯特菌（L.seeligeri）、格氏李斯特菌（L.grayi）和莫氏李斯特菌（L.murrayi）。其中，单核细胞增生性李斯特菌（LM）是一种人畜共患病的食源性致病菌，为兼性厌氧型无芽孢杆菌，广泛存在于畜禽类产品、乳制品、水产品以及土壤中，其最适生长温度为36，但在04的低温环境中仍可生长繁殖。人类受感染后主要表现为败血症、脑膜炎、胃肠炎、孕妇流产等症状。婴幼儿，老年人及免疫耐受病人临床死亡率为30%左右1。单增李斯特菌污染食品并给人类造成严重的经济损失已不是偶然事件，自20世纪80年代以来，美国、加拿大、瑞典、法国以及日本等国曾多次暴发因单增李斯特菌引起的食物中毒事件，据调查，主要传播媒介为乳制品、肉制品、水产品、果蔬和即食食品2。因此，为避免此类食品中毒事件发生，应在食品保藏与流通过程中对其进行实时监控，快速而准确的检测单增李斯特菌的消长情况3。而传统的单增李斯特菌检测方法需要经过菌种分离，生化鉴定，血清型实验等过程。操作繁琐，耗时长，检测灵敏度低，无法满足市场需求。目前，利用免疫学、代谢学、分子生物学和生物传感器等技术手段对单增李斯特菌的检测在不断的完善。其中分子生物学手段因其高效性、特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点已成为检测食品中单增李斯特菌的主要发展方向。1单核细胞增生性李斯特菌的靶基因利用分子生物学手段对致病菌进行检测时，通常根据病原菌特有的致病基因或部分特异性基因为靶基因进行引物设计或探针制备。单增李斯特菌的致病基因主要分布在LIP1毒力岛和内化素岛上，LIP1毒力岛上含有6个主要的致病基因（prfA-plcA-hlyA-mpl-actA-plcB），可促使LM感染细胞内部。其中，392专 题 综 述2014年第4期Vol.35,No.04,2014hlyA基因编码形成的李斯特菌溶血素O（listeriolysionO，LLO）是一种孔状溶血素，分子量为5860ku，为LM的主要致病因子。当hlyA基因发生变异时，上下游基因（plcA和mpl）会编码LM中其他的毒力因子以维持LM的毒性，但其致病性会明显减弱。内化素岛上含有一个多基因家族（inlA、inlB、inlC、inlC2D、inlD、inlE、inlF、inlG和inlH），其中InlA和InlB分别与钙粘蛋白和补体分子CIq受体结合，从而介导LM进入上皮细胞，肝细胞，成纤维细胞等4-5。其他毒力因子如自溶素酰胺酶（Ami）、肌动蛋白聚集因子（ActA）、纤连蛋白结合蛋白A（FbpA）、细胞壁水解酶（P60）、自溶素（auto）等会协同参与LM的黏附和侵袭6。如，LM会在plcA基因编码形成的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶（PI-PLC）的裂解作用下逃离吞噬体进入胞液，并在己糖磷酸盐转运蛋白的作用下摄取细胞质中的营养成分以进行增殖7，在此过程中，actA基因编码的肌动蛋白聚集因子（ActA）促进LM在细胞内和细胞间运动8。因此，在检测食品中单增李斯特菌时，可选LIP1毒力岛和内化素岛上相应的毒力基因（肌动蛋白聚集基因actA、溶血素基因hlyA、磷脂酶基因plcA，plcB9、细胞壁水解酶编码基因iap10、金属蛋白酶编码基因mpl11、内化素基因家族inlA、inlB、inlAB、主要毒力基因的转录调控因子prfA12）为靶基因进行特异性检验。2PCR检测技术聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），是早期发展起来的一种分子生物学检测技术，近几年，PCR技术因其特异性强、稳定性高、重复性好等优点已经成为检测单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血弧菌等食源性致病菌的常规手段。在特异性方面，谭炳乾等13对单增李斯特菌溶血素（LLO）的编码基因（hlyA）设计特异性引物，利用PCR技术对靶基因进行扩增，结果可知，通过该技术以及此特异性引物可以从多种致病菌（沙门氏菌、链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌），以及李斯特菌属的五个种（绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌和格氏李斯特菌）中特异性筛选出单增李斯特菌，随后应用该方法对市场上随机抽取的81个食品样品进行致病菌污染调查，结果与国家标准检测结果一致。利用传统的生化鉴定法检测食品中单增李斯特菌时通常需要47d，而通过PCR技术检测，则可明显缩短检测时间，该技术的应用很大程度上简化了检测步骤。Xiaohui Zhou等14根据actA基因设计特异性引物，以LM等多种致病菌的DNA为模板进行PCR扩增。结果显示，51株LM在827bp处出现特异性条带，而其他致病菌均无此条带出现，全部检测时间为18h。此外，因PCR技术的简便性、通用性以及易操作性，可在单增李斯特菌污染调查方面进行广泛应用，Pengbo Ning等15通过利用该技术对hlyA基因进行扩增，从而对中国生牛奶行业进行了初步调查，调查包括5211份样品，历时16个月，涉及15个省市。调查结果显示我国生牛奶中单增李斯特菌的污染情况并不是十分严重，污染率仅为0.36%。相比之下，伊朗16、西班牙17、日本18以及哥伦比亚19等国家生牛奶中LM的污染情况分别为2.5%、3.62%、5%、25.93%。但是，在此过程中，PCR技术却无法对在检测过程中出现的死亡菌株进行识别，往往会出现假阳性条带。3多重PCR检测技术多重聚合酶链式反应（multiplex polymerase chainreaction，MPCR），是在传统的PCR技术平台上发展起来的，与常规PCR相比，多重PCR技术可大大简化实验步骤，缩短检测时间以及节约耗材，如徐伟等20根据单增李斯特菌的prfA基因和志贺氏菌的ipaH基因设计引物，并进行多重PCR扩增，建立了在同一反应体系中同时检测两种致病菌的方法。Beili Zhou等21利用多重PCR技术同时检测了6种食源性致病菌（肠道沙门氏菌、大肠杆菌O157H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和弯曲杆菌），该检测过程共耗时为4h，每次检测费约为10美元，为目前即经济又快速的检测方法之一。单增李斯特菌具有16种血清型，其中只有1/2a、1/2b、4b三种血清型能够引起李斯特菌病22。将多重PCR技术应用在LM血清型鉴定和种属鉴定具有一定的便捷性。Dongyou Liu等23利用该技术对LM中的inlA、inlC、inlJ基因同时进行扩增，从而确定了具有致病性的单增李斯特菌。在食品污染调查方面，Jio Ryu等24选取李斯特菌种属间的差异序列为靶基因，利用多重PCR技术同时对李斯特菌种属进行辨别，并且从加工过的肉制品中检测出93株李斯特菌，其中81株为L.monocytogenes、10株L.innocua和2株L.welshimeri。但是，多重PCR技术并不是简单的将多对引物加入同一反应管中进行扩增，在设计引物时应使退火温度较为接近，扩增产物大小具有较大的的差别，并尽量避免引物之间相互干扰。4实时PCR（Real-time PCR）技术实时PCR也可称作实时荧光定量PCR（Real-timefluorescence qualitative PCR），是指将荧光基团加入到PCR反应体系中，在整个PCR进程中对荧光信号的积累进行实时监测，通过绘制的标准曲线对模板进行定量分析的技术方法。实时PCR技术的核酸扩增是在封闭的系统中完成的，扩增完成后不需要进行电泳分析，这样不但减少了对样品的污染机会，而且也避免了污染造成的假阳性结果，更缩短了检测时间。王娉等25以单增李斯特菌高度保守性序列溶血素O基因部分片段为靶基因26，对奶液中单增李斯特菌进行增菌后，定量检测该菌，从而建立了Real-timePCR检测方法，检测过程仅需1.5h。在食品加工厂对单增李斯特菌抽样检测过程中，Real-time PCR检测技术具有一定开发空间，并且已逐渐成为标准方法。Justin O Grady等27利用该技术对单增李斯特菌的ssrA基因进行扩增，从而对食品工厂和零售批发商中175个随机样品进行检测，与ISO11290-1标准方法相比，检测特异性为99.4%，灵敏度为96.15%，准确率为99.03%，检测时间可以从原来的7d缩短到2d。此 外，多 重 实 时 PCR（multiplexreal-timepolymerase chain reaction）结合了实时荧光PCR定量检测和多重PCR节省检测成本的优势，近几年在食393Science and Technology of Food Industry专 题 综 述2014年第4期源性致病菌领域也得到广泛应用，如Alejandro Garrido等28利用多重实时PCR技术建立了一种同时检测食品中单增李斯特菌、沙门氏菌以及大肠杆菌O157H7的方法，并且最低检出限可以达到5cfu/25g。随后，利用该方法对食品和环境中的152个样品进行了抽样检查，结果显示，对单增李斯特菌和沙门氏菌以及大肠杆菌O157H7逐个检测和同时检测的效率分别为91%和98%29。5环介导等温核酸扩增（LAMP）技术2000年日本荣研株式会的Tsugunori Notomi等30开发了一种特异性强、灵敏度高、检测时间短以及较为经济的核酸扩增方法，即环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，简称 LAMP），LAMP法是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在恒温条件（65左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点，1h左右可将DNA片段扩增1091010倍31，可通过肉眼判断检测结果。易海华等32初步建立了荧光定量LAMP检测方法，通过结果可知，LAMP法可在0.5h内完成食品中单增李斯特菌的检测工作，对PCR产物进行10倍稀释后发现，其灵敏度高出PCR检测技术100倍，检出限可达到1.72101拷贝/反应。同样，Li Wang等33也对LM的检测方法进行了研究，可在45分钟内完成检测，并且该方法可特异性检测出182株LM。在灵敏度方面，LAMP技术以96.7%的检出率高于PCR技术的91.2%。随着LAMP技术的不断成熟，XiaoxiaoShan等34采用热解法提取单增李斯特菌的基因组DNA，在63恒温条件下进行扩增，使得该技术最低检出限可达到6cfu/反应。通过综合比较，同样的处理条件下，LAMP检测技术的灵敏性普遍高于PCR技术，该技术简单易行，只需一台恒温仪器便可完成检测过程，具有一定的普及性。目前，市场上已有对单增李斯特菌的LAMP检测试剂盒35，并有关部门也已将该方法写成进出口检验标准以供参考。6NASBA技术NASBA（Nucleicacidsequence-basedamplification）技术是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术36，整个扩增过程在恒温条件下进行，不需要特殊的控温装置，该技术使用3种酶（逆转录酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶）以及2条特别设计的寡核苷酸引物。上游引物5 末端含有噬菌体T7 RNA聚合酶的启动子序列，下游引物的5 末端含有与钌标的电化学发光检测探针互补的序列，NASBA是一种连续扩增技术，并不像PCR技术需要实时退火，所以在同一时间内，NASBA拥有比PCR更高的扩增效率37。检测周期约为46h，并且检测结果具有一定的特异性。NASBA曾是一项较为成熟病毒检测技术，近几年，也已将该技术应用于检测食品中致病性病原菌。如M.Uyttendaele等38根据LM的16s rRNA为靶基因设计引物，利用NASBA技术对李斯特菌属进行检测，结果可以特异性的检测出LM，其敏感性可达到106cfu/mL。该项技术不但对LM的检出效率高，而且还可以与Real-time PCR技术相结合对LM进行定量检测。如Anna Nadal等39以单增李斯特菌中的hlyA基因的mRNA序列为靶基因进行验证，并进一步将分子信标实时PCR技术与NASBA技术相结合对LM进行了检测和鉴定，该方法具有较高的效率和灵敏度。7核酸探针杂交核酸探针杂交技术（molecular hybridization）是以待测微生物高度保守的DNA序列为模板设计特异探针，其最大的特点是特异性强以及具有一定的敏感性。核酸探针技术在单增李斯特菌检测方面应用较为广泛，可灵敏、快速、直接、稳定地检测出致病微生物，并且不受非致病微生物的影响40。A.Ingianni等41运用核酸探针技术对单增李斯特菌中毒力基因inlA进行了验证，发现其特异性和灵敏度均较强，可在李斯特菌属的七个种中特异性检测出单增李斯特菌，并将其应用到186个食品样品中进行进一步验证，结果表明，在肉制品中检出10株LM，其检出率为6.9%。Xiaofeng Zhang等42以16s RNA部分基因序列为靶基因进行了肽核酸荧光原位杂交，在实际应用中，从85株李斯特菌属中特异性检出37株单增李斯特菌。Okwumabua O等43运用高敏感性吖啶酯标记的DNA探针与目标序列进行碱基互补杂交，通过发光机监测双链杂交DNA分子，与李斯特菌属其他菌株相比，对LM检测的特异性和敏感性均为100%，对来源于不同食品的296株菌落检测，与传统的生理生化法检测结果一致，该项技术可在3045min内完成50100份样品的检测。但是，同位素标记基团的放射性污染，检测步骤复杂，价格昂贵等不足之处使得该技术仍存在一定的局限性。此外，C Niederhauser等44分别应用核酸杂交技术与PCR技术对软奶酪中污染的LM进行了检测，结果发现，核酸杂交技术在灵敏性和特异性方面均低于PCR技术的检测结果。随着核酸探针技术的逐渐成熟，人们将多个DNA特异性探针固定到芯片上，制成基因芯片，采用荧光标记法提高检测灵敏度。该技术可同时用于多种不同种类病原菌或毒素的检测，减少实验次数，减小工作量45。8基因芯片（DNA microarray）基因芯片是在多种微生物基因组序列被确定之后出现的一种新兴检测技术46。基因芯片又称：DNAchip、DNA array、DNA microarray、Oligonucleotidemicroarray，是采用原位合成或显微点样技术将大量DNA探针有规律地固化于玻璃芯片或者硅芯片载体上，然后与待测的标记样品按碱基配对原理杂交，通过放射自显影、激光共聚焦荧光检测系统等扫描芯片，对杂交信号检测分析，获得样品的基因序列、基因表达等遗传信息47。近几年，利用基因芯片技术对食源性致病菌检测的研究逐渐增多。并且其具有高通量、灵敏度高、可并行检测等优点。如，Biao Suo等48利用基因芯片与多重PCR相结合的技术同时检测了大肠杆菌O157H7、沙门氏菌的3个种、空肠弯杆菌以及单增李斯特菌。与探针杂交相比只能检测出十几种基因，基因芯片却可固定数以百万个探针，为食源性致病微生物的高通量检测提供了非常有用的394专 题 综 述2014年第4期Vol.35,No.04,2014工具49。Jihyun Bang等50研制了一种含有60种不同大小单增李斯特菌的未知DNA片段的基因芯片，将其与不同来源的单增李斯特菌，李斯特菌属以及不同的食源性致病菌相互杂交后，结果显示，单增李斯特菌的检出率为98%100%，其他李斯特氏菌属的检出率为7%85%，其他食源性致病菌的检出率为032%。对牛奶中单增李斯特氏菌的最低检出限为34cfu/mL。通过实验结果可以看到，利用基因芯片技术对多种食源性致病菌的检出率差距较大。可见，基因芯片技术作为刚刚开发的技术，仍然存在许多不足，如样品制备过程复杂，检测成本昂贵，缺少标准化程序等，还无法成为国际通用的检测方法。9展望应用分子生物学方法对食品中的单增李斯特菌检测，虽然具有一定的高效性、特异性强，步骤简单等特点，但在实际操作中仍然存在很多不足之处，如：a.靶基因的选取以及设计引物是否合适都会影响PCR的扩增结果，往往会出现非特异性条带；b.食品中的糖类、盐类、以及有机成分都会干扰PCR扩增结果，经常会有假阴性或假阳性结果出现；c.对于已经死亡的微生物，经常会被作为活菌检测出来，直接影响检测结果。由此可见，单一技术对食品中单增李斯特菌的检测尚存在一定的缺点，而将多种技术相结合可以起到取长补短的优势，如优化荧光探针技术与基因芯片技术后，可以在同一检测平台上同时检测数百种不同来源的LM以及食品中常见的其他病原菌，这将成为未来食源性病原菌检测的发展趋势。此外，为了更简便、快捷的检测食品中LM的污染情况，将生物传感器与分子生物学等相关技术进行合理的结合，从而在一定程度上缩短检测时间使其真正做到对LM的快速检测可能会成为今后的研究热点。参考文献1 Marija Z，Konrad J D，Wolfgang K.Practical relevance ofmethodologies for detecting and tracing of Listeria monocytogenesin ready-to-eat foods and manufacture environmentsJ.FoodScience and Technology，2011，44（2）：351-362.2 萨仁高娃，胡文忠，姜爱丽，等.产单核细胞增生性李斯特氏菌致病机制的研究进展J.食品工业科技，2013，34（1）：372-376.3 徐文君，周 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