单核细胞增生李斯特菌hfq基因缺失株的构建及其生物学特性.pdf
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1、esearch Paper研究报告微生物学报 Acta Microbiologica Sinica55(4):433 439;4 April 2015ISSN 0001 6209;CN 11 1995/Qhttp:/journals im ac cn/actamicrocndoi:10.13343/j cnki wsxb 20140342基金项目:国家自然科学基金(31101841,31472193);江苏省科技支撑计划(BE2012367)*通信作者。Tel:+86-514-87971136;Fax:+86-514-87311374;E-mail:yylan yzu edu cn作者简介:康
2、美琴(),女,河北人,硕士研究生,从事人兽共患病原菌的分子致病机理相关研究。收稿日期:2014-07-03;修回日期:2014-11-03单核细胞增生李斯特菌 hfq 基因缺失株的构建及其生物学特性康美琴,蔡雪薛,谈卫军,段斐斐,赵丹,潘志明,殷月兰*,焦新安扬州大学,江苏省人兽共患病重点实验室,江苏省动物主要疫病防控协同创新中心,江苏 扬州225009摘要:【目的】单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)为革兰氏阳性的短杆菌,营腐生和寄生生活,是重要的食源性人兽共患病原菌,对低温、酸碱和高渗透压等环境具有较强的抵抗力。Lm 在各种环境中适应、生存并表现致病力
3、,是与调控因子的网络调控密切相关,本文初步研究了细菌调控因子 hfq 的生物学特性。【方法】利用同源重组技术对血清型为 1/2 a 的 EGDe 菌株进行 hfq 基因的敲除,对获得的突变株EGDehfq 进行生化鉴定及生物学特性研究。【结果】实验结果表明:在4低温环境下,缺失株生长显著减慢(P 0.05);在含7%NaCl 高渗 BHI 培养基及含4.5%乙醇的 BHI 培养基中生长受到抑制;缺失株形成生物被膜的能力显著下降(P 0.05);对 Caco-2 细胞系的侵袭能力下降;与野生型菌株相比,EGDehfq 对BALB/c 小鼠的感染能力减弱、半数致死剂量提高。【结论】由此表明,Hfq
4、 蛋白对细菌抗胁迫、生物被膜形成及细菌毒力具有重要的调控作用。此缺失株的构建为进一步研究 Hfq 的功能提供了材料,为研究其在 Lm胁迫环境生存及疾病预防控制奠定了基础。关键词:单核细胞增生性李斯特菌,hfq 基因,调控因子,致病性,胁迫应答中图分类号:Q933文章编号:0001-6209(2015)04-0433-07单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种重要的食源性病原菌,作为一种兼性胞内寄生菌,可在巨噬细胞和非吞噬细胞(如上皮细胞、内皮细胞和肝细胞)内增殖,可引起哺乳动物和人的败血症、脑膜炎,以及孕畜流产等1 3。Lm 所引起的李斯特菌病,对畜牧
5、业造成经济损失,对人类健康造成严重威胁。早在 20 世纪 90 年代,WHO 将该菌列为食品中的四大致病菌之一,引起各国的普遍关注4。Lm 的致病性与毒力与相关调控因子的表达有着直接关系,深入研究其分子致病机理,对于李斯特菌病的预防和控制显得尤为必要。Hfq 也称 Host factor I(HF-I),是一种热稳定蛋白,首次从金黄色葡萄球菌中发现,其结构和细菌Sm 蛋白相似,通过形成同源六聚体与 sNAs、DNA或 NA 的结合,调控细菌基因的转录和翻译,有利于细菌对生存环境的适应,以及对致病性方面有所影响5。在不同细菌中 Hfq 的大小和功能有所不同,如大肠杆菌中 Hfq 是核糖核酸调节的
6、关键调节子,hfq 缺失株在高温、氧化、酸、渗透压等条件下生存、繁殖能力减弱6 7。另外,布鲁氏菌 hfq 缺失株在营养匮乏、氧化、酸等不良环境中生存、繁殖能力丧失8。Hfq 是李斯特菌重要毒力调节因子,由 hfq基因编码,可与反式编码的 sNAs 互作调控基因的转译5,该因子与李斯特菌毒力基因及其它潜在基Meiqin Kang et al/Acta Microbiologica Sinica(2015)55(4)因的表达有关,从而对李斯特菌的侵袭起到调控作用。本研究通过同源重组的方法从基因组中缺失hfq 基因,并对缺失株的生物学特性进行了研究。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和质粒:大肠
7、杆菌(Escherichia coli)DH5、单核细胞增生李斯特菌血清型为 1/2 a 的野生型菌株 EGDe、穿梭载体 pKSV7(Ampr)质粒均由本室保存;pMD18-T 购自 TaKaa 公司。1.1.2实验动物:BALB/c 小鼠由扬州大学比较医学中心提供。1.1.3培养基:试剂 BHI 培养基(BactoTM BrainHeart Infusion)购自 BD 公司。1.1.4主要试剂和仪器:细菌基因组 DNA 抽提纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司;DNA 聚合酶、高保真DNA 聚合酶、DNA 回收试剂盒及限制性核酸内切酶(BamH 、Xbal )、DNA 分子标准量 Ma
8、rker均购自大连宝生物(TaKaa)公司;T4 DNA 连接酶购自 Promega 公司;氨苄青霉素、氯霉素、红霉素等购自Sigma 公司;电转化仪购自 Eppendorf;培养箱购自上海跃进医疗器械厂;摇床、离心机购自Thermo,凝胶成像系统购自伯乐生命医学产品有限公司。1.1.5引物:表 1 为本研究中使用的引物,参照GenBank 上公布的基因序列设计,由南京金斯瑞公司合成。表 1 目的基因引物序列Table 1 Primers sequences of target genesPrimerSequence(53)estriction sitehfqaFACTGGGATCCGGAAT
9、AGGATGGAGATTGATTGGATBamH IhfqaTTGTCTTTTAAGTAACGTGCAATTTCCCTCTCCAATCTCTATCTThfqbFAAGATAGAGATTGGAGAGGGAAATTGCACGTTACTTAAAAGACAAhfqbAGCCTCTAGAAATAATCCGCGCCTCAACAGCAGCCXbahfqaFTGTGGCATTGGCTACAAAGAhfqbACGGTGCTGTTCAACATGCGTT1.2EGDehfq 突变株的构建以单核细胞增生李斯特菌标准株 EGDe 为材料,用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取 EGDe 的基因组。以引物 hfqaF 和
10、hfqa、hfqbF 和 hfqb 分别扩增上下游同源臂片段 hfqa、hfqb。PC 产物经DNA 回收试剂盒纯化回收,再以 hfqaF 和 hfqb 为引物,通过 SOEing PC 将 hfqa、hfqb 连接起来,命名为 hfqab。再与 pMD20T 载体相连,转化至 E coliDH5 中,经 PC 鉴定及 BamHI、XbaI 的双酶切分析,将阳性克隆送金斯特公司测序。以 BamH和XbaI 分 别 双 酶 切 阳 性 克 隆 pMD20T-hfqab 和pKSV7,纯化后用 T4 DNA 连接酶进行连接、转化大肠杆菌 DH5。将测序正确的阳性克隆命名为pKSV7-hfqab。用
11、电转化方法将重组穿梭质粒导入野生型 EGDe 菌株,通过温度和氯霉素抗性压力进行同源重组,然后在 30无抗性压力下传 10 代,使载体丢失,获得在氯霉素(10 g/mL)抗性中不能生长且经 PC 和 T-PC 鉴定正确的菌株 EGDehfq。1.3EGDe 和 EGDehfq 对 NaCl 耐受性的测定两株细菌接种到新鲜 BHI 培养基中过夜培养,次日取细菌,13800 g 离心 2 min。PBS 重悬,测定此时的 OD600值。将处理后细菌分别转接到 10 mL质量分数为 7%NaCl 的 BHI 培养基或体积分数为4.5%乙醇的 BHI 培养基的三角瓶中,并使其初始OD600值为 0.0
12、5,每个细菌设 3 个平行组,置 37摇床振摇培养,定时测定各瓶的 OD600值并记录实验数据。1.4EGDe 和 EGDehfq 在 4及 40温度条件下生长的测定将细菌接种到新鲜 BHI 培养基中过夜培养,次日取 1 mL 菌液,PBS 清洗 2 遍并重悬,然后分别转接细菌到 10 mL BHI 培养基的三角瓶中,每个细菌设 3 个平行组,令初始 OD600值为 0.05,分别置 4 和 40 摇床振摇培养并定时测定各瓶的OD600值。1.5EGDe 和 EGDehfq 生物被膜形成能力比较构成生物被膜的胞外多糖易于结晶紫结合,可434康美琴等:单核细胞增生李斯特菌 hfq 基因缺失株的构
13、建及其生物学特性/微生物学报(2015)55(4)利用胞外多糖的量来衡量生物被膜的生成量。收集过夜培养基于指形管,用 BHI 液体培养基调整各细菌 OD600值为 1.0,稀释 10 倍后(OD600约为 0.1),取200 L 菌悬液加入 96 孔 U 形细胞培养板中,于37条件下培养 72 h。于 72 h 时吸走培养基,无菌SW 洗 3 遍,用 0.1%的结晶紫染色,再用无菌 SW洗 3 遍,55烘干后每孔滴加 225 L 96%乙醇洗脱15 min,使用酶标仪测量其在 595 nm 下的吸光度值。1.6细胞侵袭实验挑取生长良好的 Caco-2 细胞,消化转移一定数量细胞至 24 孔细胞
14、培养板中,至细胞培养至单层时,对板孔内的细胞计数,然后按细菌与细胞的数量比(MOI)20 加入新鲜培养的野生株 EGDe 和缺失株EGDehfq,继续培养,1 h 后换用含硫酸庆大霉素(100 g/mL)的 DMEM 培养 2 h。用无菌 PBS 清洗2 次,加入冷的 0.1%Triton X-100 裂解细胞 8 min,释放细菌。用无菌 PBS 稀释裂解液,选择 10 倍和100 倍稀释梯度涂布于 BHI 平板上,置于 37温箱培养 20 h 后对菌落计数。1.7野 生 株 EGDe 及 缺 失 株 EGDe hfq 对BALB/c 小鼠的感染实验取 37过夜培养的两种菌液,次日转接到新鲜
15、培养基中培养 3 h,将细菌用 PBS 洗 2 遍,调整其OD600至 0.8,再调整细菌量为 3 105CFU,将 6 周龄BALB/c 小鼠随机分成 2 组,每组 3 只,分别感染EGDe 与 EGDehfq。每只小鼠腹腔注射 100 L 3104CFU 细菌。3 天后,分别摘取每组小鼠的脾脏和部分肝脏,均质仪研磨后将组织液稀释并平板计数。1.8野 生 株 EGDe 及 缺 失 株 EGDe hfq 对BALB/c 小鼠的 LD50测定37 培养细菌制备种子液,次日将种子液按1 20的比例重新接种于新鲜的 BHI 液体培养基中,于 37振荡培养,用无菌 PBS 洗 2 遍,调整 OD600
16、值至所需大小。将 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠随机分成2 组,每组 5 只,进行腹腔注射。每只小鼠注射剂量为 100 L 并呈五倍递减,同时将细菌适度稀释后涂布 BHI 培养板进行菌落计数。连续观察 14 天,并记录小鼠死亡情况。采用 eed-Muench 方法计算重组菌对雌性 BALB/c 小鼠的半数致死量。2结果2.1重组菌构建结果2.1.1上下游片段 hfqa、hfqb 的扩增:以单核细胞增生李斯特菌标准株 EGDe 基因组 DNA 作为模板,分别合成 hfq 基因上下游片段 hfqa、hfqb,电泳结果显示产物大小与预期片段大小 253、467 bp 相符。2.1.2pMD20-T
17、-hfqab 的构建及鉴定:将通过SOEing PC 拼接片段连接至 pMD20-T 载体,转化到 DH5 中,提取质粒通过 Xba、BamH双酶切鉴定分别得到2700 bp 的载体片段和675 bp 的目的片段,与预期结果相符。2.1.3pKSV7-hfqab 的构建及鉴定:用 Xbal、BamH双酶切鉴定重组克隆,得到 7000 bp 的载体片段和 675 bp 的同源片段,与预期结果相符。2.1.4缺失株的鉴定:用 PC 鉴定转化产物,结果显示在 997 bp 处有清晰的目的条带,说明缺失株构建成功。分别提取 EGDe、EGDehfq 总 NA 并反转录为 cDNA,以得到的 cDNA
18、为模板进行反转录PC。电泳结果显示野生株能扩增出特异性条带,大小为 234 bp(图 1),缺失株无此条带。实验进一步证明 hfq 基因已成功缺失。图 1 T-PC 鉴定缺失株 EGDe、EGDehfqFigure 1 The result of T-PC identification of EGDehfq M:DL2000 Marker,lane 1:positive control,lane 2:PC product ofEGDe,lane 3:PC product of EGDehfq2.2Lm 抗胁迫实验结果2.2.1Lm 对 NaCl 耐受性测定:在等渗溶液中,微生物可正常生长繁殖;
19、在高渗溶液中,细菌的细胞失水收缩,从而生长繁殖受到抑制。对 NaCl 耐受性测定结果表明,EGDe、EGDehfq 在含 7%NaCl 的BHI 培养基中生长受到明显抑制,进入稳定期时间延后(图 2)。此外,缺失株 EGDehfq 的生长趋势534Meiqin Kang et al/Acta Microbiologica Sinica(2015)55(4)较野生株减慢,10 h 时 EGDe 的活菌数是缺失株EGDehfq 的2 倍。由此表明7%NaCl 渗透强度明显抑制细菌生长和繁殖,且 Hfq 对于 Lm 耐受 7%渗透压力发挥重要作用。图 2 细菌耐盐实验结果Figure 2 Osmot
20、ic stress tolerance of EGDe and EGDehfq2.2.2Lm 对 EtOH 耐受性的测定:醇类物质可侵入菌体细胞,破坏蛋白质表面的水膜,使之失去活性,同时也破坏细菌蛋白质的肽健,使之变性。由图3 的测定结果可知,在含有 4.5%乙醇的 BHI 中,EGDe、EGDehfq 的生长都受到抑制,但随着时间推移 EGDehfq 的生长能力较野生株下降,在测定范围内,12 h 时二者达到最大差异,由此可见,hfq 对细菌耐受乙醇起着重要作用。图 3 EGDe、EGDehfq 耐受乙醇实验结果Figure 3 Ethanol stress tolerance of EGD
21、e and EGDehfq2.2.3低温胁迫对 Lm 生长的影响:考虑到 Lm 是一种可在低温下生长的食源性病原菌,它的耐寒特性对食物保藏和公众健康造成严重威胁。本实验测定细菌在 4培养条件下生长情况:两株细菌的生长都极其缓慢,但随着时间的推移,缺失株的生长显著低于野生株(P 0.05)(图 4),由此提示,hfq 对于细菌抵抗低温环境发挥重要作用。2.2.4高温胁迫对 Lm 生长的影响:单核细胞增生李斯特菌可以耐受 45高温,本实验探索了 Lm 于40温度条件下细菌的生长情况。图 5 中实验结果图 4 EGDe 和 EGDehfq 4生长情况Figure 4 The growth curve
22、 of EGDe and EGDehfq at 4图 5 EGDe 和 EGDehfq 37生长情况Figure 5 The growing state of of EGDe and EGDehfq at 37显示缺失株的生长趋势与野生株相同,表明 hfq 基因的缺失未对 Lm 耐受高温造成明显影响。2.3Lm 对 Caco-2 细胞系侵袭能力的测定生物被膜是细菌抵抗外界不利环境时形成的,它是一种多细胞聚合物,由细菌团块与表多糖、蛋白和胞外 DNA 构成的细胞外基质形成的复合物。由图 6 可见缺失株 EGDehfq 与野生株 EGDe 相比,形成生物被膜的能力有显著降低(P 0.05),实验表
23、明 Hfq 对于细菌应对外界不利条件形成自我保护的生物被膜具有重要作用。2.4细胞侵袭实验已知与黏附、侵袭及胞内繁殖相关的基因主要存在于 Lm 毒力岛 LIPI-I 和 LIPI-II 中,其中 LIPI-II上的基因编码一组与侵袭素功能相似的蛋白,主导细菌对非吞噬细胞的黏附侵袭。图 7 的侵袭实验结果表明,EGDehfq 的侵袭能力(0.786%)明显低于野生株 EGDe(2.242%),说明缺失 hfq 基因后,细菌侵入 Caco-2 细胞的能力减弱。2.5野 生 株 EGDe 及 缺 失 株 EGDe hfq 对BALB/c 小鼠的感染实验由图 8 的实验结果可知,EGDehfq 感染小
24、鼠634康美琴等:单核细胞增生李斯特菌 hfq 基因缺失株的构建及其生物学特性/微生物学报(2015)55(4)图 6 Lm 于 37 BHI 生物被膜形成能力测定Figure 6 Determination of ability of biofilm formation of Lm in BHI at37图 7 EGDe 和 EGDehfq 细胞侵袭实验结果Figure 7 esult of cell invasion of EGDe and EGDehfq后的肝脏和脾脏中的细菌载量均低于野生株EGDe,表明缺失株对小鼠的感染能力减弱,毒力降低,Hfq 对李斯特菌致病性有重要作用。图8 EG
25、De、EGDehfq 对 BALB/c 小鼠感染实验测定结果Figure 8 The CFUs ofEGDe and EGDehfq in mice organs2.6野 生 株 EGDe 及 缺 失 株 EGDe hfq 对BALB/c 小鼠的 LD50测定经 eed-Muench 法计算得到 EGDehfq 对小鼠半数致死量为 3.54 106CFU,EGDe 对小鼠半数致死量为 5.92 105CFU,hfq 缺失株的半数致死量较其亲本株提高了 6 倍,表明缺失株的毒力明显降低(表 2)。表 2 EGDe 和 EGDehfq 菌株对 BALB/c 小鼠 LD50的测定结果Table 2
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