TaqMan探针法荧光定量PCR检测鲜切甜瓜中单核细胞增多性李斯特菌的研究.pdf
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1、297TaqMan 探针法荧光定量 PC检测鲜切甜瓜中单核细胞增多性李斯特菌的研究关棣锴1,2,胡文忠2,*,朴永哲2,冯可3(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)摘要:根据多条单核细胞增多性李斯特菌的 hly 基因序列,设计了 1 对简并引物和 1 条 TaqMan 探针,建立荧光定量PC 快速检测单核细胞增多性李斯特菌的方法,对该方法的特异性、灵敏度进行了验证,并采用该法对染菌的鲜切甜瓜进行了检测。结果表明,该方法具有较好的特异性,对质粒标准品的灵敏度为 1.12
2、 102copies/L,对染菌的鲜切甜瓜中单核细胞增多性李斯特菌的最低检出限为 6.28 102cfu/mL。该方法可为快速检测鲜切果蔬病原微生物污染度及其控制奠定技术基础。关键词:单核细胞增多性李斯特菌,hly 基因,荧光定量 PC,TaqMan 探针,鲜切甜瓜Study on detection of Listeria monocytogenes in freshcut melonwith TaqManbased fluorescence quantitative PCGUAN Dikai1,2,HU Wenzhong2,*,PIAO Yongzhe2,FENG Ke3(1.Colleg
3、e of Food,Dalian polytechnic university,Dalian116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)Abstract:According to the multiple hly gene sequences of Listeria m
4、onocytogenes,a pair of degenerate primersand a probe was designed,and the method of realtime fluorogenic quantitative PC assay to detection of Listeriamonocytogenes was established,the specificity and sensitivity were verified;its preliminary application in artificialinoculation freshcut melon was r
5、ealized.The results showed that the method had good specificity and sensitivityfor plasmid standard was 1.12 102copies/L,the minimum detection limit of artificial inoculation freshcut melonwas 6.28 102cfu/mL.This method can lay a technology foundation to detect and control the pathogenicmicroorganis
6、m of freshcut fruits and vegetables.Key words:Listeria monocytogenes;hly gene;real time fluorogenic quantitative PC;TaqMan probe;fresh cut melon中图分类号:TS207文献标识码:A文 章 编 号:10020306(2014)19029704doi:10 13386/j issn1002 0306 2014 19 055收稿日期:20140509作者简介:关棣锴(1988),女,在读硕士,研究方向:食品科学。*通讯作者:胡文忠(1959),男,教授,研究
7、方向:食品科学。基金项目:国家自然科学基金项目(31172009,31340038);国家科技支撑计划项目(2012BAD 38B05);大连市科技计划项目(2012E13SF106);大连市金州新区科技计划项目(2012A1049)。单 核 细 胞 增 多 性 李 斯 特 菌(Listeriamonocytogenes)是一种能引起人畜共患的食源性致病菌,多通过食品经口感染,该菌已被列为二十世纪 90年代四大食品致病菌之一,成为许多国家食品卫生的必检项目,其可诱发食物中毒,导致李斯特菌病,主要引起人类脑膜炎、败血症等,发病率虽低,致死率却高达 30%。鲜切果蔬作为即食性食品,易受微生物污染,
8、而目前国内关于此方面研究鲜有报道,但近年常有单核细胞增多性李斯特菌污染果蔬类食品而导致人体患病的现象。因此,本研究以此为切入点,选取鲜切甜瓜为材料,进行了荧光定量 PC 快速检测单核细胞增多性李斯特菌的初步研究。本研究根据单核细胞增多性李斯特菌的 hly 基因序列所设计的简并引物和探针特异性良好,可检测多种不同298来源的单核细胞增多性李斯特菌,灵敏度较高,为鲜活农产品的质量与安全控制研究提供技术支持。1材料与方法1.1材料与仪器单核细胞增多性李斯特菌(ATCC 19111、ATCC19112、ATCC 19115、ATCC 15313)、英诺克李斯特氏菌 ATCC 33090、格氏李斯特氏菌
9、 ATCC 25401、伊氏李斯特氏菌 ATCC 19119、威氏李斯特氏菌 ATCC35897、斯氏李斯特氏菌 ATCC 35967中国工业微生物菌种保藏管理中心;单核细胞增多性李斯特菌GIM 1.229北京北纳创联生物技术研究院;大肠埃希氏菌 O157H7 NCTC 12900、大肠埃希氏菌 ATCC8739、金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、乙型副伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50094、伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50071、鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028、痢疾志贺氏菌CMCC(B)51105、藤黄微球菌 CMCC(B)28001、蜡样芽孢杆菌 CMCC(B)63301、奇异变形
10、杆菌 CMCC(B)49005中国微生物菌种网;核酸纯化试剂盒、pMD18TVector、DH5 感 受 态 细 胞、小 量 质 粒 提 取 试 剂、Premix Ex TaqTM(Probe qPC)宝生物工程(大连)有限公司;磁珠法细菌 DNA 提取试剂盒北京普华仕科技发展有限公司。实验材料为附近超市中鲜切的伊丽莎白瓜。Thermo Scientific Pikoeal 实时 PC 仪、ThermoScientific Arktik 热循环仪Thermo 公司。1.2引物及探针的设计根据从 NCBI 中下载的多条单核细胞增多性李斯特菌 hly 基因序列,用 Primer5.0 进行引物和探
11、针设计,且找出简并碱基,预计扩增产物长度为 180bp,由宝生物工程(大连)有限公司合成引物和探针。简并引物上游:5GGATGAATAAATTATGATCC3;下游:5 ATCAATTACCGTTCTCCAC3;探针:5(FAM)GCACTGGTTTAGCTTGGGAATGG(Eclipse)3。1.3细菌 DNA 的提取取 1mL 37过夜培养的单核细胞增多性李斯特菌菌液,12000r/min 离心 2min,菌沉淀按照磁珠法细菌 DNA 提取试剂盒的操作说明提取基因组。通过紫外分光光度计测定 OD260、OD280 值后确定提取DNA 的浓度及纯度,根据测得的 OD260 值换算成DNA
12、浓度,根据 OD260/OD280 确定 DNA 纯度,一般认为比值在 1.82.0 之间适宜。1.4质粒标准品的构建以提取的单核细胞增多性李斯特菌基因组 DNA为模板,用简并引物对其进行 PC 扩增,切胶回收、纯化扩增产物,扩增产物与载体 pMD18T 连接后转化至大肠杆菌 DH5 感受态细胞中,涂板筛选,疑似阳性的菌落进行培养后,抽提质粒,进行 PC 扩增,鉴定为阳性重组质粒的送往宝生物工程(大连)有限公司进行测序。用紫外分光光度法进行纯度和浓度的分析后,10 倍倍比梯度稀释作为标准品。1.5荧光定量 PC 反应体系和反应条件本实验所采用的反应体系为 20L:Premix ExTaqTM(
13、Probe qPC)10L,上 游 引 物(10mol/L)0.8L,下游引物(10mol/L)0.8L,探针 1L,模板2.0L,无菌水 5.4L。反应条件为:95,30s 预变性;95,30s;60,30s;扩增 40 个循环。1.6引物的特异性验证根据 1.4 提取 5 株单核细胞增多性李斯特菌和15 株非单核细胞增多性李斯特菌基因组,以其作为模板,且设无菌水为阴性对照,按照 1.5 进行荧光定量 PC 扩增,验证引物特异性。1.7标准曲线的建立及灵敏度的确定方法 1.4 制备的质粒标准品浓度为 1.12 1091.12copies/L,作为模板,按照 1.5 进行荧光定量PC 扩增,以
14、模板的拷贝数为横坐标,以其对应的循环阈值(Cq 值)为纵坐标,建立标准曲线,并确定灵敏度。1.8染菌鲜切甜瓜最低检出限的确定将单核细胞增多性李斯特菌接种于 5mL TSBYE培养基中,37 过夜培养,取 1mL 菌液喷于称取的25g 鲜切甜瓜上,加入 225mL TSBYE,37增菌过夜。用均质器拍打后,取均质液,用 1%的蛋白胨水进行10 倍倍比稀释。取各稀释度的菌液涂平板,37 培养 24h 后进行菌落计数。同时再取上述各稀释度的菌液 1mL,12000r/min 离心 2min,菌沉淀按照 1.3 提取基因组 DNA,然后按照 1.5 进行荧光定量 PC扩增。2结果与分析2.1重组质粒的
15、鉴定重组质粒通过 PC 和酶切鉴定后,将阳性重组质粒送往宝生物工程(大连)有限公司测序后,与NCBI 网站上进行在线 BLAST 比对分析,结果表明扩增产物与单核细胞增多性李斯特菌的 hly 基因相应区域 99%同源。2.2荧光定量 PC 特异性检测用建立的荧光定量 PC 方法检测 5 株单核细胞增多性李斯特菌和 15 株非单核细胞增多性李斯特菌菌株,结果见图1。由图1 可知,5 株单核细胞增多性李斯特菌均有扩增曲线生成,结果为阳性,且循环阈值均小于 30,其它 15 株非单核细胞增多性李斯特菌菌株及阴性对照无菌水的检测结果为阴性,表明建立的荧光定量 PC 方法特异性良好。2.3标准曲线的建立
16、及灵敏度的确定以质粒标准品作为模板,进行荧光定量 PC 扩增,获得荧光定量 PC 扩增曲线,见图 2。根据得到扩增曲线,以各质粒标准品拷贝数的对数为横坐标,以其对应的 Cq 值为纵坐标,建立标准曲线,见图 3。由图 3 可知,Cq 值和各质粒标准品拷贝数的对数具有良好的线性关系,标准曲线相关系数为 2=0.9912,线性方程为:y=4.313x+52.182。由图 2 可以得出,当质粒标准品的浓度为 1.12 102copies/L 时,仍有扩增曲线出现,表明该方法的单核细 胞 增 多 性 李 斯 特 菌 的 灵 敏 度 为 1.12 102copies/L。2.4染菌鲜切甜瓜最低检出限的确定
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