λ-卡拉胶寡糖对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制作用及凋亡相关基因表达.pdf
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1、4 7 4 药学学报A c t aP h a r m a c e u t i c aS i n i c a2 0 0 8,4 3(5):4 7 4 4 7 9A 卡拉胶寡糖对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制作用及凋亡相关基因表达宓婷艳1,严小军h,陈海敏1,林晶1,王峰2,徐炜烽2(1 宁波大学浙江省海洋生物工程重点实验室,浙江宁波3 1 5 2 1 1;2 浙江省宁波市李惠利医院检验科,浙江宁波3 1 5 0 4 1)摘要:为了探讨A-卡拉胶寡糖(A c a r r a g e e n a no l i g o s a c c h a r i d e s,A-C O)在体外抑制人脐静脉内皮细胞(H
2、 U V E C)增殖作用及其分子机制,采用M T T 法检测A C O 对H U V E C 存活率的影响,通过流式细胞技术检测A-C O 对H U V E C增殖周期的影响,测定细胞凋亡率,检测用药前后活性半胱氨酸蛋白酶-3(c a s p a s e-3)的变化。同时采用半定量R T-P C R 方法检测凋亡相关基因m R N A 的表达情况。M T T 检测结果显示,A C O 在高浓度(Im g-m L“)能明显抑制细胞增殖。流式细胞仪检测到A-C O 作用H U V E C 后,出现早期凋亡细胞,且凋亡呈浓度和时间依赖性;对细胞增殖周期的检测结果显示,与对照组相比,A C O 作用
3、后G 期细胞比例减少,S 期比例增加,并出现凋亡峰;活化的c a s p a s e 3 比例亦随用药浓度的加大而增加。R T-P C R 检测发现0 3m g m L“A C O 作用人脐静脉内皮细胞1 2、2 4和3 6h 后,细胞T N F a、p 5 3、c a s p a s e-8、c a s p a s e-3 的m R N A 表达上调。表明A-C O 能剂量依赖性地诱导H U V E C 细胞凋亡,并引起H U V E C 的S 期阻滞,其机制可能与促进T N F a、p 5 3、c a s p a s e 一8、c a s p a s e-3 等基因的转录,使细胞内活化的c
4、 a s p a s e-3 水平增加有关。关键词:A 一卡拉胶寡糖;脐静脉内皮细胞;T N F a;p 5 3;e a s p a s e-8;e a s p a s e-3中围分类号:R 9 6 3文献标识码:A文章编号:0 5 1 3 4 8 7 0(2 0 0 8)0 5 0 4 7 4 0 6P r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o no fA-c a r r a g e e n a no l i g o s a c c h a r i d e so nH U V E Ca n de x p r e s s i o no fa p o p
5、t o t i cr e l e v a n tg e n e sM IT i n g y a n l,Y A NX i a o-j u n h,C H E NH a i m i n l,L I NJ i n l,W A N GF e n 9 2,X UW e i f e n 9 2(J M a r i n eB i o t e c h n o l o g yL a b o r a t o r y,N i n g b oU n w e 乃i t y,N i n g b o3 1 5 2 1 1,C h i n a;2 D e p a r t m e n to fC l i n i c a lL
6、 a b o r a t o r y。L i h a i l iH o s p i t a lo fN i n g b oM e d i c a lC e n t e r,N i n g b o3 1 5 0 4 1,C h i n a)A b s t r a c t:T os t u d yt h ea n t i p r o l i f e r a t i o ne f f e c to fA-c a r r a g e e n a no l i g o s a c c h a r i d e s(A C O)o nh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n
7、d o t h e l i a lc e l l s(H U V E C s)a n de x p r e s s i o no fa p o p t o t i cr e l e v a n tg e n e s,t h ei n f l u e n c eo fA C Oo nH U V E C sp r o l i f e:r a t i o nw a sm e a s u r e db yM T Ta s s a y;a p o p t o t i cr a t e。c e l lc y c l ed i s t r i b u t i o na n dt h el e v e lo
8、fa c t i v ec a s p a s e-3o fH U V E C sw e r ea n a l y z e du s i n gf l o wc y t o m e t r y;t h em R N Al e v e l o fa p o p t o s i sr e l a t e dg e n e sw a sd e t e r m i n e db yR T P C R A tah i i g hc o n c e n t r a t i o no f1m g m L,A C Os i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d t h
9、ee n d o t h e l i a lc e l lp r o l i f e r a t i o n A n n e x i n VF I T C P Id o u b l es t a i na s s a ys h o w e dt h a tw h e nt r e a t e dw i t h0,0 8,lm g m L 一1o fA-C Of o r2 4h,c e l la p o p t o t i cr a t e sw e r e(1 6 7 1 6),(1 1 4 8 2 4)a n d(1 3 8 14-2 2),r e s p e c t i v e l y,w
10、 h e nt r e a t e df o r4 8h,c e l la p o p t o t i cr a t e sw e r e(2 0 2 2 3),(1 3 8 4 1 9)a n d(3 8 7 24-2 5),r e s p e c t i v e l y,c e l lc y c l ea s s a ys h o w e dt h ed e c r e a s eo fc e l l si nG o G p h a s e。a n di n c r e a s ei nSp h a s e F u r t h e r m o r e。w eo b s e r v e dt
11、 h el e v e lo fa c t i v ec a s p a s e-3i n c r e a s e di nad o s e d e p e n d e n tm a n n e ra t2 4t ha n d4 8t h R T P C Rr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt u R N Ao fT N F a p 5 3,c a s p a s e-8a n dc a s p a s e-3i nc e U si n c r e a s e da f t e rt r e a t e dw i t hA-C O A C Oi n d
12、u c ea p o p t o s i so f收稿日期:2 0 0 7 1 0-2 4 基金项且:教育部高校科技创新重大培育基金(7 0 5 0 2 8);科技部国际合作项目(国科外2 0 0 5-2 6 2-0 5 0 5);浙江省自然科学基金(Y 5 0 6 1 3 2)通讯作者T e l:8 6 5 7 4 8 7 6 0 0 4 5 8,E m a i l:x i a o j t m y a n h o t m a i l c o r n 万方数据宓婷艳等:A 卡拉胶寡糖对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制作用及凋亡相关基因表达H U V E C si nad o s e d e p e
13、n d e n tw a ya n da r r e s t sc e l l sa tSp h a s e,w h i c hm a i n l yd u et ot h eu p r e g u l a t i o no fa p o p t o t i cg e n e ss u c ha sT N F a,p 5 3,c a s p a s e-8,c a s p a s e-3a n di n c r e a s et h el e v e lo fa c t i v ec a s p a s e-3 K e yw o r d s:A c a r r a g e e n a no l
14、 i g o s a c c h a r i d e;H U V E C;T N F a;p 5 3;c a s p a s e-8;c a s p a s e 一3A-卡拉胶是一种从海洋红藻(诸如角叉菜、杉藻、麒麟菜)中提取得到的水溶液多糖,其结构具有重复的a(1-4)一D 一半乳吡喃糖胡一(1 3)一D 一半乳吡喃糖二糖单元骨架,骨架上的多个位置取代有硫酸基团,因此A 一卡拉胶是一种高硫酸酯化的天然多糖资源,其降解产物A 一卡拉胶寡糖的活性研究已得到充分的开展,如抗凝血、抗病毒、抗肿瘤曲1 等。肿瘤的生长和转移与肿瘤周围的血管有密切的关系,肿瘤血管为肿瘤细胞的生长输送营养并排泄代谢产物,转
15、移灶的形成和发展也依赖于新生血管的形成1。越来越多的证据证明血管生成在人肿瘤发展中有重要作用,如能有效抑制血管新生,切断肿瘤血供,有望达到抑制肿瘤生长、发展及转移的目的,因此,以新生血管为靶点是肿瘤生物治疗的重要策略之一。血管的新生涉及一个复杂的过程,其中内皮细胞是控制血管生成过程的主要靶分子。近年来有关硫酸酯化多糖和寡糖的抗血管新生的报道较多。卜1 1 1,作者采用鸡胚尿囊膜模型观察到A-卡拉胶寡糖(A c a r r a g e e n a no l i g o s a c c h a r i d e s,A C O)具有显著的新生微血管抑制作用”。为了进一步研究A 一卡拉胶寡糖的作用机制
16、,本研究选择人脐静脉内皮细胞(H U V E C)为研究对象,采用流式细胞技术检测细胞周期及凋亡率,同时采用R T P C R 等检测T N F a、p 5 3、c a s p a s e 一8、c a s p a s e-3 等凋亡相关基因的m R N A 表达,以期探讨A 一卡拉胶寡糖对人脐静脉内皮细胞凋亡的诱导作用及其分子机制。材料与方法材料人脐静脉内皮细胞H U V E C 由A T C C 提供。A-卡拉胶寡糖(A C O)样品由宁波大学海洋生物工程实验室提供(平均相对分子质量为33 5 0,寡糖纯度9 3 5 4)。A n n e x i n V F I T C 凋亡检测试剂盒,F
17、 I T C-c o n j u g a t e dm o n o c l o n a la c t i v ec a s p a s e-3a n t i b o d ya p o p t o s i s 试剂盒,c y c l et e s tp l u sD N Ar e a g e n t 试剂盒均购自B DB i o s c i e n c e sP h a r m i n g e n 公司。参考G e n e B a n k 上基因序列,用P r i m e rp r e m i e r5 0 设计引物,并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成:口a c t i n 上游引物5 一
18、T C CT G TG G CA T CC A CG A AA C T-3,下游5-G A AG C A7 I T rG C GG T G G A CG A T 一37,扩增片段长度为3 1 5b p;T N F a 上游引物5 C A GA G G G A AG A GT r CC C CA G-3,下游5-C C TT G GT C TG G TA G GA G AC G-3,扩增片段长度为3 2 0b p;C a s p a s e-8 上游引物5 一G G GA C AG G AA T GG A AC A CA C TT G G-37,下游5 T C AG G AT G GT G AG
19、 A AT A TC A TC G CC 3,扩增片段长度为5 5 8b p;C a s p a s e 一3 上游引物57-C T CG G AC T GG T AC A GA T GT G CA T G 3,下游5 G G TT A AC C CG G GT A AG A AT G TG C A-3。扩增片段长度为5 4 0b p;p 5 3 上游引物5 C T GA G GT T GG C TC T GA C TG T AC C AC A AT C C-3,下游57 一C T CA T TC A GC T CT C GG A AC A TC T CG A AG C G-3,扩增片段长度为
20、3 9 0b p。M M L V 反转录酶为P r o m e g a 产品。M T T 法细胞存活率检测用M 丌法测定细胞存活率。将细胞以5 1 0 4 m L 接种于9 6 孔板,2 4h后加入不同浓度的药物,每组设5 个复孔,继续培养2 4 及4 8h 后,每孔加入5m g m L 1M T T 溶液,4h后以D M S O 溶解M T I ,并于4 9 2n m 处测吸光度(A)值。细胞周期分布测定H U V E C 接种于6 孔板,在含M E M 培养基中于3 7 培养至贴壁生长。加入或不加(对照组)浓度为0 8m g m L“和1m g m L“的A-C O,作用2 4h 和4 8
21、h。按C y c l et e s tp l u sD N Ar e a g e n t 试剂盒的操作手册处理样品。样品上流式细胞仪检测(B e c t o nD i c k i n s o n),用C e l lQ u e s t软件进行分析。细胞凋亡率测定不同浓度A C O 作用细胞2 4h 和4 8h 后,按A n n e x i n V F I T C 凋亡检测试剂盒操作手册处理细胞,上流式细胞仪分析结果。计算凋亡率,凋亡率()=(A n n e x i n V+P I+细胞数+A n n e x i n V+P I 一细胞数)1 00 0 0X 1 0 0。C a s p a s e
22、 s-3 基因表达的检测为了检测A C O作用H U V E C 后引起细胞凋亡的分子机制,用不同浓度的A-C O 作用H U V E C4 8h。按F I T C c o n j u g a t e dm o n o c l o n a la c t i v ee a s p a s e-3a n t i b o d ya p o p t o s i s 试剂盒操作说明处理细胞:用冰P B S 洗细胞2 次,再悬浮于C y t o f i x c y t o p e r m 溶液中。细胞置于冰上2 0m i n,离心,去液,用P e n n w a s hb u f f e r 洗2 次。按
23、每1 1 0 6 个细胞加入P e n n w a s hb u f f e r1 0 0 斗L 和抗体2 0p L L,室温避光孵育3 0r a i n。用P e n n w a s hb u f f e r1 万方数据药学学报A c t aP h a r m a c e u t i c aS i n i c a2 0 0 8,4 3(5):4 7 4 4 7 9m L 洗细胞,再重悬于P e r m w a s hb u f f e r0 5m L,用流式细胞仪分析。R T-P C R 检测凋亡相关基因用0 3m g m L“A C O 作用细胞1 2、2 4、3 6h 后,以T R I
24、Z O L 一步法按说明书提取各组细胞总R N A,溶于去R N a s e酶水中,用紫外分光光度仪测定R N A 浓度和纯度,一7 0 保存备用。取总R N A2 斗g,用M M L V 反转录酶将其反转录为e D N A,于一2 0 保存。取上述e D N A 进行P C R 反应。根据G e n B a n k 设计引物序列,P C R 产物用1 5 琼脂糖电泳,8 0V 电泳1h,结果用U V 凝胶成像系统(T a n o n 公司)成像,用K o d a kd i g i t a ls c i e n c e 软件分析结果。以目的基因条带吸光度邝-a e t i n 条带吸光度来表示
25、各基因m R N A表达的相对量。统计学方法所有数据均用露s 表示,采用S P S S1 0 0 软件进行方差分析。以P 0 0 5 为有统计学差异。结果1A-C O 对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用M T T 比色法显示A C O 对人脐静脉内皮细胞有一定的抑制作用,不同处理时间,对H U V E C s 的抑制作用呈现浓度依赖性趋势,在高浓度时抑制率较高(1m g m L。1 浓度作用下2 4h 时存活率为5 1 7 3,4 8h 为3 9 7 7),A-C O 的I C 5 0 值为0。8 5零鲁嘎譬C o n c e n t r a t i o n m g-m L-1F i g u r
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