Bt杀虫晶体蛋白-肠溶性微囊制备方法的初步研究.pdf
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1、3 7 4 C h i n e s eA g r i c u l t u r a lS c i e n c eB u l l e t i nV 0 1 2 4N o 112 0 0 8N o v e m b e rh t t p:w w w c a s b o r g c r lB t 杀虫晶体蛋白一肠溶性微囊制备方法的初步研究阮传清1,刘芸1,张明政2,朱琳珊2,刘波1(1 福建省农业科学院农业生物资源研究所,福州3 5 0 0 0 3;2 福建农林大学,福州3 5 0 0 0 2)摘要:I 目的】研究B t(B a c i U u st h u r i n g e n s i s)晶体蛋白
2、肠溶性微囊的削备方法,为进一步研究它对防止紫外线损伤晶体蛋白及促进晶体蛋白在害虫中肠快速释放等方面的作用奠定基础“方法】用复相乳液法制备肠溶性微囊,并应用L。6(4 5)正交试验设计研究相关因子对微胶囊包封率的影响;【结论】采用复相乳液法可以制备B t 晶体蛋白的肠溶性微囊。5 个因子对包封率有显著影响。影响大小依次为乳化转速H P M C P 浓度(壁材)B t 晶体蛋白含量(芯材)蓖麻油含量(助剂)甲基纤维素浓度(亲水胶体)。以5 0 0 m 1分散系为条件。筛选出的肠溶性微胶囊较佳工艺为:8 6 m g m L B t 晶体蛋白溶液l m l,2 0 m g m L H P M C P溶
3、液5 0 m l 及蓖麻油2 m l,三者混合并在匀化器转速6 0 0 0 r m i n 下乳化,而后分散于2 1 或3 3 甲基纤维素钠溶液中成囊。关键词:苏云金芽孢杆茵(B a c i l l u st h u r i n g e n s i s);肠溶性微胶囊;B t 伴孢晶体蛋白中图分类号:Q 9 3 9 9 5文献标识码:AE l e m e n t a r ys t u d i e so nt h ep r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo fe n t e r i cm i c r o c a p s u l eo fi n s e c
4、 t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n sf r o mB a c i l l u st h u r i n g e n s i sb yo r t h o g o n a lm a t r i xm e t h o dR u a nC h u a n q i n 9 1,L i uY u n l,Z h a n gM i n g z h e n 9 2,Z h uL i n s h a n 2,L i uB 0 1(1 I n s t i t u t eo f A g r o-b i o l o g i e a lR e s o u r c e s,
5、F u j i a nAc a d e m yo f A g r i c u l t u r eS c i e n c e s,F u z h o u3 5 0 0 0 3;2 F u j i a nA g r i c u l t u r ea n dF o r e s t r yU n i e e 瑙U y,F u z h o u3 5 0 0 0 2)A b s t r a c t:O B J E C T I V E T h ep a p e ra i m e dt or e s e a r c ht h ep r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo
6、 fe n t e r i cm i c r o c a p s u l e so fi n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s(I C P)o fB a c i l l u st h u r i n g e n s i s(s t)M e t h o d D o u b l ee m u l s i o nm e t h o dw a su s e df o rt h ee f f o r tt op r e p a r ee n t e r i cm i c m e a p s u l e sw i t hI C Pa sc o
7、r em a t e r i a la n dh y d r o x y p r o p y lm e t h y l c e l l u l o s ep h t h a l a t e(H P M C P)a ss h e Hm a t e r i a l E x p e r i m e n ti no r t h o g o n a lm a t r i xd e s i g n L 1 6(4 5)】W i l l su s e dt ov a l u et h ei n f l u e n c eo ft h er e l e v a n te l e m e n t s R e s
8、 u l t s E n t e r i c。m i c r o c a p s u l e sw r a p p i n gI C Pc o u l db ep r e p a r e db yd o u-b l ee m u l s i o nm e t h o d T h ee n c a p s u l a t i o no fI C Pw a si n f l u e n c e db yf a c t o r ss u c ha se m u l s i f i c a t i o nr o t a t i o ns p e e d,c o n c e n t r a t i o
9、no fs h e l la n dc o r em a t e r i a l s,e m u l s i f i c a t i o na g e n ta n dh y d r o c o l l o i d s,w h i c hw e r eh s t e di nap a t t e r no fd e c r e a s i n gi m p o r t a n c e I n5 0 0m la q u e o u sm e d i u mf o rf o r m a t i o no ft h em i c r o c a p s u l e s,t h eo p t i-m
10、a lt e c h n o l o g yw a st oe m u l s i f y1m l8 6 m g m LI P C,5 0 m l2 0 m g m LH P M C Pa n d2m lc a s t o ro i la te m u l s i f i-c a t i o nr o t a t i o ns p e e do f6 0 0 0r m i n t h e nd i s p e r s et h ee m u l s i o ni n2 1 o r3 3 c a r b o x y m e t h y lc e H u l o s ef C M C-N a)K
11、e yw o r d s:B a c i l l u st h u r i n g e n s i s,e n t e r i cm i c r o c a p s u l e,B tc r y s t a lp r o t e i n s基金项目:福建省自然科学基金项目(Z 0 5 1 6 0 5 7);福建农业科学院创新基金(C 2 0 0 7 Q J 0 2)和国影8 6 3”计划(2 0 0 6 A A l 0 A 2 1 2)第一作者简介:阮传清,男,1 9 7 4 年出生,福建周宁人,主要从事生物农药研究。通信地址:3 5 0 0 0 3 福建省福州市五四路2 4 7 号农科院内生
12、物技术研究所,T e l:0 5 9 1-8 7 8 4 8 9 3 3,E m a i l:r u a n国cq1 6 3c o m通讯作者:刘波,男,1 9 5 7 年出生,福建惠安人,研究员,博士,主要从事生物技术和生物防治研究。通信地址:3 5 0 0 0 3 福州市五四路2 4 7 号福建省农业科学院,T c l:0 5 9 1 8 7 8 4 8 9 3 3,E-r e a l h l a e p t b 1 6 3 c o m。收穑日期:2 0 0 8-0 8-0 4,修回日期:2 0 0 8 0 8 2 7。万方数据中国摩擘礓撮第2 4 卷第1 1 期2 0 0 8 年1 1
13、月h t t p:l l w w w e a s b o r g c n3 7 5 苏云金芽孢杆菌(B a c i l l u st h u r i n g i e n s i s,简称B t)因具有绿色、环保等优点而倍受青睐,成为了目前研究最深,应用最广的一种微生物类杀虫剂【1 1。分离的B t 菌种已达7 0 个H 血清型,8 3 个亚种,B t 制剂产量占所有活体微生物杀虫剂的比例达9 0 以上 2 1。但是现有的B t制剂仍存在单种制剂杀虫谱较窄、杀虫速率慢、易受紫外线损伤而迅速失效等问题,田间杀虫效果仍不如化学农药理想。如何提高田间杀虫效果一直是应用B t 防治害虫的工作重点【3】。
14、微胶囊技术是用成膜材料把药物包裹形成微小粒子的一种技术,由此形成的微胶囊可以有效防止环境因素对有效药物的损伤,是农药剂型的主要发展方向之一闱。肠溶性微胶囊是近年发展起来的一种可控释放药物的微胶囊类型。它不仅可以保护被包裹的药物免受紫外线及酸性环境的损伤,而且可以在人或动物肠道定位溶解、释放药物,达到充分发挥药物活性的目的。肠溶性成膜材料工业的发展及微胶囊制各技术的成熟大大降低了肠溶性微胶囊剂的生产成本,促进了肠溶性微胶囊的推广应用嘲。目前肠溶性微胶囊的应用研究主要集中在医药行业方面,市上已出现了多种商品化产品嗍。肠溶性微胶囊在杀虫剂中的研究尚无报道。笔者根据鳞翅目中肠环境为碱性,p H显著高于
15、田间环境的特点 9 1,选用p H 依赖型高分子物质羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯(H P M C P)为囊壁材料,以B t 的活性杀虫物质伴孢晶体蛋白为囊芯,研究该种肠溶性微胶囊的基本制备工艺,为应用肠溶性微胶囊保护B t 免受紫外线损伤、提高B t 杀虫效果开辟新途径。同时也为其它生物农药剂型的研究提供参考。1 材料与方法1 1 试验时间、地点试验于2 0 0 8 年3 月3 日至5 月9 日在福建省农业科学院农业生物资源研究所完成。1 2 试验材料试验采用的B t 晶体产生菌为该研究所保存的菌株B tL S Z 9 4 0 8。参考朱育菁(2 0 0 5)的方法【l O l 生产B t 发酵
16、液。伴孢晶体通过液体双相法 1 1 1 分离提取,再碱裂解获得B t 晶体蛋白溶液,蛋白含量为8 6 m g m L。其它试剂为:羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯(H P M C P)、甲基纤维素钠(C M C-N a)、蓖麻油等。主要仪器有F S H 2 A 匀浆机(江苏金伟试验仪器厂)、7 8 1 磁力搅拌器(国华电器有限公司)、S i g m a 高速冷冻离心机(德国)、岛津U V 2 5 5 0 型紫外分光光度计(日本)、S I M S 5 0 0 0 0 M i l l i p o r e 超纯水系统(法国)等。1 3 试验方法1 3 1 肠溶性微胶囊基本制备方法以H P M C P 为壁
17、材,按以下步聚制备B t 晶体蛋白的肠溶性微胶囊:(1)称取H P M C P,溶于丙酮乙醇(1:1v v)混合液中,配成溶液I。(2)将B t 晶体蛋白溶液、蓖麻油与溶液I 混合,采用匀浆机进行搅拌使其分散均匀,由此得到w o 的乳液I I。(3)配制亲水胶体溶液,在磁力搅拌器搅拌下将乳液缓慢分散于其中,得到w o w 的双乳液。将其置于磁力搅拌器上,温度3 0 低速搅拌,让溶剂丙酮慢速蒸发,同时微胶囊生成。(4)2 0 m i n 后静止混合液,待沉淀出现时弃去上清,沉淀即是肠溶性微胶囊。1 3 2 微胶囊配方的正交试验设计采用L l。(4 5)正交设计表,对搅拌速度、芯材含量、囊壁材料浓
18、度、乳化剂含量、亲水胶体浓度等5 个因素进行研究,每个因素设4个水平,因素与水平列于表l。试验共1 6 个处理,试验设计参见表2,制备方法如1 1 2 所述。试验设3 次重复。表1 正交试验因素及水平1 3 3B t 晶体蛋白含量的测定与包封率计算将通过不同处理制得的微胶囊离心、洗涤数次后,在抽真空条件下干燥,称重。称取一定量的微胶囊,经p H 8 5 碱性缓冲液裂解,然后采用f o l i l l 酚法测定吸收值。另采用牛血清白蛋白制定f o l i n 酚标准曲线。由此各处理得微胶囊的B t 晶体蛋白含量,计算包封率。包封率=微胶囊B t 蛋白总含量B t 蛋白加入量。2 结果与分析2 1
19、 正交试验结果以H P M C P 为壁材、B t 晶体蛋白为芯材,对乳化转速、芯材含量、囊壁材料浓度、乳化剂含量、亲水胶体浓度等5 个因素,分别设定4 个水平,进行L。(4 5)微胶囊化正交试验。结果,不同组合制备的微胶囊对B t 晶体蛋白的包封率如表2 所示。5 号配方的包封率最高,为8 9 4;其次为1、6、7、8 号配方,包封率为4 9 6-5 8 3;万方数据C h i n e s eA g r i c u l t u r a lS c i e n c eB u l l e t i nV 0 1 2 4N o 112 0 0 8N o v e m b e r3 7 6 h t t p
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