抗河豚毒素单克隆抗体联酶前纯化条件优化的研究.pdf

书书书!#$!中国食品卫生杂志%&()*)+,-.(/0,11,2&3 4 )()56!7 年第 58 卷第 7 期论著抗河豚毒素单克隆抗体联酶前纯化条件优化的研究韩春卉!张林5!张宏元!李楠!张靖!江涛!李凤琴!9国家食品安全风险评估中心 卫生部食品安全风险评估重点实验室北京$!6665!#59北京市朝阳区常营社区卫生服务中心北京$!6665#$摘$要!目的$了解不同辛酸浓度下盐析法不同离心力对抗河豚毒素#:;$单克隆抗体的纯化效果以及纯化后酶标抗体性能的影响!优化出纯化抗:;单克隆抗体的方法!为免疫学方法检测:;提供依据%方法$在传统辛酸!纯化过程中离心力!6 666?A B C 时纯化获得的抗体虽然产量有所下降但纯度较高!酶标抗体的生物活性各项指标均最优%结论$经过对抗:;单克隆抗体纯度抗体中蛋白含量酶标抗体各项性能 指 标 的 对 比!优 化 出 用 于 抗:;抗 体 纯 化 用 腹 水 稀 释 液 与 辛 酸 比 值!666!#!$离 心 力!6 666?A B C的试验条件%关键词!河豚毒素&单克隆抗体纯化&改良过碘酸钠法&)0 */方法中图分类号!.D9 7$文献标识码!/$文章编号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收稿日期!56!7 65 5E基金项目!国家高技术研究发展计划ED7 计划!56!5/!6!D67#作者简介韩春卉$女$副主任技师$研究方向为生物毒素检测)A F B W GF CJ Z GHCGHB 665Ea!D7_ Z K A通信作者李凤琴$女$研究员$研究方向为食品微生物)A F B W W B R M CJ NB CaZ R T F _ CM Q _ Z C$河豚肉味鲜美$营养丰富$深受消费者喜爱$但食用 或 误 食 河 豚 引 起 的 河 豚 毒 素 Q M Q?K SK CQ K B C$:;#中毒是我国沿海地区食物中毒的主要死因为了给消费者提供安全无毒的河豚(防止中毒事件的发生$世界各国学者对:;的检测技术进行了多方面的研究$建立了诸如小鼠生物实验法(荧光法(紫外分光光度法(薄层色谱法(气相色谱法(高效液相色谱法(毛细管等速电泳法等多种方法 小鼠法操作简便$但费时费力$影响因素较多$且目前我国大陆尚未建立小鼠生物实验法的标准曲线和小鼠品系&仪器法虽然准确$但技术要求较高$仪器昂贵$样品的前处理繁琐且对样品提取液的净化度要求较高$不适用于现场检测$难以在基层推广使用本文建立了一种快速(灵敏(经济(适于基层推广的抗河豚毒素单克隆抗体联酶前纯化条件优化的研究!韩春卉$等!8$!检测:;的 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 M C L A MW B CUM SB A A HCK T K?PM CQ F T T F L$)0 */#方法河豚毒素单克隆抗体与辣根过氧化物酶的有效连接是用)0 */方法直接对:;进行定性(定量快速检测的前提$但抗体纯化过程中抗体产量会随着其纯度的增加而下降$由此导致检测灵敏度的降低 为了优化传统的辛酸 硫酸铵沉淀法对抗:;单克隆抗体纯化的试验条件$以期最大限度地在保证抗:;单克隆抗体纯度的同时$确保抗体的工作效价$本研究对纯化抗:;单克隆抗体的各种方法进行比较$同时对不同纯化方法获得的单克隆抗体连接辣根过氧化物酶后的各项指标及抗体生物活性等进行比较$优化出高纯度(高蛋白含量(可用于联酶及易于放大的抗:;单克隆抗体纯化方法)!*!$材料与方法!9!$主要仪器与试剂磁力控温搅拌仪(酶标仪(电泳仪(凝胶成像仪(高速冷冻离心机(紫外分光光度计(&计(透析袋(移液器(D 孔)0 */可拆板%K T Q F?$美国#拜发 X%/蛋 白定量试剂 盒(:;D2 细 胞 株:;O 0&免疫小鼠筛选获得#产生的含有抗:;单克隆抗体的同批次小鼠腹水本实验室自制#(:;5!#的比例加入 69 6D A K W 0&89 6 的醋酸缓冲液$磁力搅拌 5 A B C 按腹水醋酸缓冲液与辛酸!666!(!666 55(!666 77!#的比例边搅拌边逐滴加入辛酸$并用!A K W 0的(F,&调&至#9 8$室温静置 76 A B C 后$8 666?A B C 离心!8 A B C 上清经 5 层纱布 过 滤后 置透析 袋 中$于56 倍体积 69 68 A K W 0&b9 5 的=X*中#c透析过夜$每隔#G 更换透析液取出透析后的腹水并测量其体积$按每!66 A W腹水加入 589 E J 硫酸铵的比例$室温下边搅拌边缓缓加入硫酸铵粉末$加入后继续搅拌!8 A B C$用氨水调&至 b9#$#c静置 5 d#G 后于#c!6 666?A B C 离心!8 A B C$弃上清液$沉淀溶于等体积的=X*中 加入饱和硫酸铵溶液沉淀使溶液中硫酸铵的最终浓度为#8e#$重复该步骤两次 沉淀溶于相当初始腹水体积的=X*中$于=X*中#c透析过夜$E 666?A B C 离心!A B C 去除不溶性沉淀$上清即为纯化好的抗体取纯化好的抗体上清及未纯化的腹水$通过X%/试剂盒对总蛋白纯化前和纯化后的含量进行测定获得总蛋白回收率$并测定纯化蛋白中抗体滴度$观察不同的辛酸浓度对抗:;单克隆抗体活性的影响$优化抗体纯化所需的适宜辛酸用量 同时用浓度为 69!58!J A W 的:;5!#的比例加入 69 6D A K W 0&89 6 醋酸缓冲液$磁 力 搅 拌 5 A B C 按 上 述 腹 水 稀 释 液 与 辛 酸!666!#的比例边搅拌边逐滴加入辛酸$此后按照!9 59!中+并用!A K W 0的(F,&调&至#9 8,步骤进行$纯化后的抗体溶液用紫外分光光度计在 5E6 和 5D6 CA处分别测定其,2值$并调整蛋白浓度至!69 6 A J A W 备用方法二%基本步骤同上$不同之处一是加入辛酸后离心速度由 8 666?A B C 增至!6 666?A B C$以使沉淀下来的杂蛋白含量多于方法一&其次为硫酸铵对蛋白沉淀的提取过程中$离心速度由!6 666?A B C 减至 8 666?A B C$以增加抗河豚毒素单克隆抗体的纯度!9 59 7$酶标抗:;单克隆抗体)#*#9 6 A J 辣根过氧化物酶用!9 6 A W 双蒸水溶解$加入 69!A W 新配制的 69!A K W 0过碘酸钠$室温轻微避光搅拌 56 A B C 后$置于 69 66!A K W 0( #的!666 A W 醋酸缓冲液中透析过夜$每#G 更换透析液将上述辣根过氧化物酶溶液和纯化后的抗体等体积混合$室温下避光轻搅拌 5 G$加入 69!A W 新配制的#A J A W 硼氢化 钠 溶 液$#c 放 置 5 G 后 于69 65 A K W 0(&b9 5 db9#的=X*中透析过夜$每#G 更换透 析 液 透 析 后 的 溶 液 置 于 烧 杯 中$按!9 59!中+按每!66 A W 腹水加入 589 E J 硫酸铵的比例,步骤进行纯化 收集纯化后的酶标抗体测定其,25D6(,25E6(,2#67值$计算各项指标参数后$加等体积69!A K W 0 的海藻糖$分装后低温冻干并保存!D$!中国食品卫生杂志%&()*)+,-.(/0,11,2&3 4 )()56!7 年第 58 卷第 7 期!9 59#$酶标抗:;单克隆抗体与河豚毒素竞争活性的评价)8*用)0 */法评价抗:;单克隆抗体的生物活性及检测灵敏度 即用浓度为 69!58 CJ A W 的:;!#$并作为后续腹水纯化研究中使用的辛酸添加量浓度表!$不同辛酸浓度纯化的抗体中蛋白含量及活性结果:F PW M!$2 M Q M?A B CF Q B K C K R?K Q M B C Z K CQ M CQ F CS F Z Q B B Q LH?B R B M S PLSB R R M?M CQ Z F?L W B ZF Z B S抗体编号腹水与辛酸比!#蛋白量A J A W#蛋白回收率e#不同抗体稀释度下的,2值!566!#66!E66!D66!7 566!D#66!5 E66!58 D66!号!666!9#D68E9 E#!9 6!7!9 6769 E8!9 6!69 669 E#D69 b5b69 8b#5 号!666 5569 b879 5!9 6!5!9 6669 E69 7D69 E8#69 b5!69#E!69#7!7 号!666 7769 E7789 E69 Db!69 87#69 7E869 5bD69!b#69!69 6869 6E8注%!F(5F分别为用方法一(方法二纯化后的抗体溶液!6 倍稀释后的电泳结果&!P(!Z(5P(5Z分别为方法一(方法二纯化后的抗体溶液 56 倍稀释后的电泳结果图!$不同辛酸浓度纯化抗:;抗体后的电泳结果1 B J H?M!$)W M Z Q?K GK?M T B TF CF W L T B TF CQ B :;H?B R B M SPLSB R R M?M CQ Z F?L W B ZF Z B S$方法一和方法二蛋白质浓度经紫外吸收测定分别为!E9 8E 和!79 D8 A J A W$综合以上结果$方法一纯化的蛋白总量优于方法二59 5$两种方法纯化抗体联酶后的纯度分析结果)b*将两种纯化方法获得的抗体蛋白联酶$经!6 倍稀释后对联酶后的纯度(各项性能指标进行分析$结果见表 5表 5$两种方法纯化后酶标抗体各项指标分析:F PW M5$CSM F CF W L T B TK R M C L A M#666!#$方法二联酶的:;抗体工作浓度为!E 666!#$因此方法二的抗体活性比方法一高一倍$方法二优于方法一表 7$两种方法纯化后的抗体联酶后与毒素的竞争曲线测定:F PW M 7$2 M Q M?A B CF Q B K C K R Q GMZ K A M Q B Q B MZ H?MK R F R Q M?Q GMF CQ B PK SL !#$!6 666?A B C 离心力的试验条件7$讨论在免疫学实验中$制备高特异性(高效价的抗$体是实验的基础$抗体质量的高低将直接影响实验的成败 通过不同方法制备的抗体往往与多种杂蛋白混杂在一起$为了获得成分相对单一的抗体或将抗体用于特定的用途$就需要进行抗体纯化 抗体分子是一类蛋白质分子$与其他蛋白质一样$它有一定的等电点(溶解度(荷电性及疏水性$因此本试验选择盐析沉淀技术进行抗体蛋白的分离(纯化$并经蛋白含量测定(电泳方法确定纯化蛋白中抗体含量和纯度 在抗体联酶时需要抗体纯度高$生物活性高$但纯化过程中随着纯度增高$纯化蛋白中抗体产量下降$试验过程中选择适宜的离心速度可有效地去除腹水中的杂蛋白 虽然方法二存在总蛋白含量低于方法一的缺陷$但考虑到其联酶后的抗体生物活性效价#高于方法一$因此认为方法二优于方法一$但要切实了解纯度与活性的关系还要做进一步的定量分析 本试验根据蛋白质的物理性质优化了试验条件$改善了纯化目的抗体的纯度和提高联酶后抗体生物活性的关系$为联酶前抗体纯化方法的改进提供依据$为酶标抗体的理论研究和生产应用提供了必要的实验基础参考文献)!*$王建伟$王德斌$罗雪云$等_ 抗豚毒素单克隆抗体的制备及其特性的初步研究)+*_ 卫生研究$!D$588#%76E 7!6_)5*$周玉$李岩松$潘风光$等_ 小鼠腹水 J 4类单克隆抗体纯化方法的研究)+*_ 黑龙江畜牧兽医$566D!6#%!#!D_)7*$邓宁$向军俭$饶桂荣$等_ 重组人源性抗&X T/J1 F P 抗体纯化方 法 的 比 较 研 究)+*_ 生 物 工 程 学 报$566#$56 D#%EE#EE_)#*$刘继明$邱玉华$张毅$等_ 小鼠腹水 J V型单抗的纯化)+*_中国免疫学杂志$!$!8#%86!867_)8*$刘琦$张爱华$石磊_ 两种抗体纯化方法对乙肝核心抗体酶标试剂盒质量的影响)+*_ 华中科技大学学报%医学版$5665$7!#%!6E 566_)D*$岳喜庆$冯巧萍$张和平$等_ 牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化)+*_ 中国乳品工业$5668$777#%!D 5!_)b*$黄祯祥$洪涛$刘崇柏_ 医学病毒学基础及实验技术)V*_ 北京%科学出版社$!6%5!6 5!5_-!#$-关于同意将冬青科苦丁茶作为普通食品管理的批复卫计生函%56!7&ED 号海南省卫生厅你厅(关于调整冬青科苦丁茶为普通食品的请示)#琼卫法规*56!5+7E 号$收悉%经研究!我委同意将冬青科苦丁茶#W M UHSB CJ Z GF%_+_:T M CJ$作为普通食品管理%生产经营上述食品应当符合有关法律法规标准规定%此复%国家卫生和计划生育委员会二一三年四月十日$