PCR法快速检测三种食源性致病菌的研究.pdf
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1、第 4 卷 第 3 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.4 No.3 2013 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2013 *通讯作者:王攀,主要研究方向为食品安全检测技术。E-mail:Jason-*Corresponding author:WANG Pan,SGS-CSTC Standards Technical Services Co.,Ltd.Shanghai Branch,5/F,The 3rd Building,No.889 Yishan Road,Xuhui District,Shanghai 200233
2、,China.E-mail:Jason- PCR 法快速检测三种食源性致病菌的研究 王 攀*,王 萍,高 林(通标标准技术服务(上海)有限公司,上海 200233)摘摘 要要:目的目的 探讨用 PCR 方法快速检测食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺氏菌(Shigella spp.)的实用性。方法方法 采用能力验证实验和超市样品检测实验对 PCR 方法与传统检测方法进行比较。结果结果 与传统检测方法相比,PCR 方法检测以上三种食源性致病菌的结果准确率达到 99%以上,假阳性率低于 1%,假阴性率为 0。结论结论
3、PCR 检测方法具有检测周期短等优点,可以在当前的食品安全检测工作中应用推广。关键词关键词:PCR 方法;沙门氏菌;金黄色葡萄球菌;志贺氏菌;食品检测 Rapid determination of three food-borne bacterial pathogens using PCR method WANG Pan*,WANG Ping,GAO Lin(SGS-CSTC Standards Technical Services Co.,Ltd.Shanghai Branch,Shanghai 200233,China)ABSTRACT:Objective To rapidly detec
4、t Salmonella spp.,Staphylococcus aureus and Shigella spp.in food by PCR.Methods The detection performance of PCR method was compared with that of traditional method by proficiency testing and testing of supermarkets samples.Results The correct rate of PCR method was more than 99%,the false positive
5、rate was less than 1%,and the false negative rate was zero.Conclusion The PCR method is high-effective in testing three food-borne bacterial pathogens,with the advantage of a short de-tection period,which could be applied in present food safety testing.KEY WORDS:PCR method;Salmonella spp.;Staphyloco
6、ccus aureus;Shigella spp.;food testing 食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因,食源性致病菌对人类健康造成的危害极大,是食品安全的重大隐患。据 WHO 估计,发达国家每年约30%的人口患食源性疾病,发展中国家情况更为严重,估计每年腹泻及相关疾病约有 2.7 亿病例,导致240 万 5 岁以下儿童死亡1。当前,在食品生产和流通中,企业和政府监管部门均需对大批食品进行致病菌的检测,样本量大、时间紧。而传统的食源性致病菌检测方法主要是细菌学培养法,通常需经富集培养、形态观察、生理生化鉴定等过程,操作复杂、耗时费力2。针对这种情况,多种食源性致病菌的 PCR 快速
7、检测方法被建立起来。如 2001 年 Ferretti 等3采用多重聚合酶链反应(PCR)技术对食品中的沙门氏菌进行了快速检测,2012 年荣策等4建立了检测鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光 PCR 法,2003 年许龙岩等5做了 PCR 方法检测志贺氏菌的研究,2006 年杨洋等6建立了乳品中金黄色葡萄球菌的 PCR 检测方法等。另外,多个国家颁布了检测食源性致病微生物的 PCR 方法标准,但基于 PCR 技术的普及程度和 PCR 技术的特点,很多食918 食品安全质量检测学报 第 4 卷 品安全检测人员对 PCR 方法检测食源性致病菌的准确性仍有怀疑,且缺乏 PCR 检测方法实际应用的数据,因此在
8、日常的食品安全检测中不能很好的接受和推广 PCR 法检测食源性致病菌。本研究通过对PCR 方法快速检测沙门氏菌(Salmonella spp.)、金黄色 葡 萄 球 菌(Staphylococcus aureus)和 志 贺 氏 菌(Shigella spp.)的实用性展开探讨,希望为广大食品致病菌检测人员提供参考。1 材料与方法 1.1 材料、试剂和设备 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌能力验证样品由通标标准技术服务(上海)有限公司(下简称SGS 上海)能力验证中心制备。超市采样检测的样品,包括自制熟食、米面点心、烘焙食品、水产品、蔬菜水果、肉类及食品接触表面涂抹取样。Oxoid 致病菌分
9、离及鉴定培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;DNA 提取试剂盒、DNA Ladder Marker、核酸回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;PCR 反应液、Taq 酶购自 TaKaRa 宝生物工程(大连)有限公司;PCR 引物由 Invitrogen 上海英骏生物技术有限公司合成。Verity 梯度 PCR 仪购自美国应用生物系统公司;高速台式离心机购自德国 Eppendorf 公司;生物电泳图像分析系统购自上海复日科技有限公司。1.2 方 法 1.2.1 传统食源性致病菌检验方法 参照 GB/T 4789.4-2010 食品微生物学检验 沙门氏菌检验7;GB/T 4789.10
10、-2010 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验8;GB/T 4789.5-2012 食品微生物学检验 志贺氏菌检验9。1.2.2 食源性致病菌 PCR 检测法 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的检测参照 SN-T 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR 法10。2 结果与分析 2.1 能力验证实验结果 借助已通过英国皇家认可委员会(UKAS)认可的SGS 上海能力验证中心制备了沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的能力验证食品样品,并设计无杂菌污染、轻度杂菌污染和全为杂菌污染三种样品类型,分别采用食源性病原菌传统检测方法和 PCR 检测方法进行对比性实验,进而评价以上三种食
11、源性病原菌的 PCR 检测方法。能力验证实验的结果见表 1,对于无杂菌和轻度杂菌污染(菌体数量按 1:1 掺入非目标菌)的样品,两种检测方法均检测出阳性结果;对于全为杂菌的样品,两种检测方法的检测结果均为未检出致病菌。从能力验证实验的结果来看,食源性致病菌传统检测方法和 PCR 检测方法的检测结果完全一致。2.2 超市采样检测结果 为了比较食源性致病菌传统检测方法和 PCR 检测法在检测常规食品上的差异,本研究从食品超市采集食品及相关样品 427 份进行食源性致病菌检测。检测结果(表 2)表明,在 118 份沙门氏菌测试样品中,传统检测方法与 PCR 检测方法均检测出 2 份样品为沙门氏菌阳性
12、;在197份金黄色葡萄球菌测试样品中,传统检测方法确认有 2 份样品为金黄色葡萄球菌阳性,而 PCR 检测方法检测出 3 份样品为金黄色葡萄球菌阳性;在 112 份志贺氏菌测试样品中,传统检测方法未检测出志贺氏菌阳性样品,PCR检测方法检测出 1 份样品为志贺氏菌阳性。按照 SN-T 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法 PCR 法的要求,所有 6 份 PCR 法检测出的致病菌阳性样品通过 GB/T 4789 的相关方法最终确认出其中 4 份样品为致病菌阳性,且样品编号与传统方法检测结果相同。为了更加直观地比较食源性致病菌传统检测方法和 PCR 检测方法,本研究以食源性致病菌传统检
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