浅论慢病毒介导靶向PRL.docx
《浅论慢病毒介导靶向PRL.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《浅论慢病毒介导靶向PRL.docx(21页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、浅论慢病毒介导靶向PRL【摘要】 【目的】 探讨肝再生磷酸酶-3(PRL-3)的表达对肝癌细胞侵袭能力的影响。【方法】 设计、合成4对针对PRL-3 基因siRNA 的寡核苷酸序列,分别构建质粒,转染293T 细胞,据其对PRL-3 的抑制率,筛选最有效的PRL-3 基因RNAi 靶序列,设计并合成其siRNA 的双链DNA Oligo,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL-GFP 线性化载体连接产生重组慢病毒质粒LV-PRL3-SiRNA,并行PCR 和测序鉴定。将LV-PRL3-SiRNA,pHelper和pHelper 三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T
2、细胞GFP蛋白的表达水平经孔稀释法测定病毒滴度。重组慢病毒感染肝癌SMCC7721 细胞,行real time-PCR和western-blot验证PRL-3基因的沉默效果。用Transwell侵袭试验检测SMCC7721细胞体外侵袭力的改变。【结果】 成功构建PRL-3 基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为6 108 Tu/mL。和对照组相比,RNA 干扰组SMMC7721 细胞PRL-3 基因的mRNA 水平和蛋白水平的抑制率分别为75%和63%;其穿过人工基底膜的平均数( )明显少于空白对照组( )及非特异性siRNA感染组( ),侵袭抑制率为58% (P)。
3、【结论】 降低PRL-3 的表达可抑制肝癌细胞的侵袭能力。【关键词】 RNA干扰; 慢病毒; PRL-3; 肝细胞癌Abstract: 【Objective】 To construct recombinant lentiviral vector expressing siRNA targeting PRL-3 gene and explore its influence on invasive potency of infected hepatocellular carcinoma cell line SMCC7721. 【Methods】 Four sequences of siRNA ta
4、rgeting PRL-3 gene were designed, of which both sense and anti-sense DNA Oligo were designed, synthesized and corresponding plasmids were constructed. The most effective sequence of siRNA was screened by efficiency of PRL-3 gene knock-down in transfected 293T cells and its DNA Oligo was cloned into
5、the pGCL-GFP vector, which contained coding gene of green fluorescent protein (GFP). The resulting recombinant lentiviral vector expressing siRNA targeting PRL-3 gene was called LV-PRL3-SiRNA, and it was confirmed by PCR and DNA sequencing. 293T cells were co-transfected with LV-PRL3-SiRNA,pHelperan
6、d pHelperand the lentivirus was produced. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP in 293T cells. SMCC7721 cells were infected with recombinant lentivirus and the silencing effect of PRL-3 gene was assessed by real-time PCR and western-blot. The invasive activity of inf
7、ected SMCC7721 cells was analyzed by Transwell invasion assay. 【Results】 Recombinant lentiviral vector expressing siRNA targeting PRL-3 gene was successfully established and confirmed by DNA sequencing. The recombinant lentivirus with the most effective PRL-3 gene knock-down were harvested from 293T
8、 cells with a viral titer of 6 108 Tu/mL. Results of real-time PCR and Western blot showed that compared with control group, PRL-3 expression in SMCC7721 早期血行播散及术后复发是肝细胞癌(HCC) 预后不良的主要原因1。关于HCC 转移复发的具体机制尚未完全明了,因此寻找与其恶性进展密切相关的分子标志物显得意义重大。蛋白酪氨酸的磷酸化与去磷酸化分别受蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKS)和蛋白酪氨酸磷酸
9、酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)的调节,是细胞生长、分化等生命活动的重要调节方式,这两种酶的作用失衡可导致蛋白酪氨酸的磷酸化水平异常,从而引起癌症等疾病的发生。PRL-3 属于PTP家族成员,近年研究发现它与人类多种恶性肿瘤的转移复发及不良预后有关3-5。但PRL-3与HCC 生物学行为间的关系尚未见报导。本研究通过慢病毒介导的RNA 干扰技术抑制肝癌细胞中PRL-3 的表达,观察肝癌细胞体外侵袭能力的改变,探讨PRL-3表达水平与肝细胞癌恶性生物学行为间的关系。1 材料和方法材 料人肝癌细胞SMCC-7721、293T 细胞及大肠杆菌DH5由本院中
10、心实验室保存。慢病毒包装系统由pGC-LV载体、pHelper 载体和pHelper载体三质粒组成,购自吉凯公司,限制性内切酶Age和EcoR、琼脂糖凝胶回收试剂盒及T4连接酶购自New England Biolabs(NEB)公司, PRL-3鼠抗人多克隆抗体(ab503276)及鼠抗人-actin 单克隆抗体(英国ABCAM公司),HRP标记羊抗鼠二抗、BCA 蛋白质定量试剂盒(美国PIERCE公司),胎牛血清(美国GIBCO 公司),大量质粒DNA提取试剂盒购自Qiagen 公司,细胞总RNA 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司),SYBR Prime ScriptTM RT-PCR
11、Kit(大连宝生物工程有限公司),细胞可溶性总蛋白提取试剂盒(美国CST公司),dNTP 及Rnase Inhibitor 购自Promega 公司。Oligo dT 购自上海生工,RNase-free的物品都购自Axygen。Matrigel (BD Pharmingen,Bedford, USA), Transwell chambers (Corning, NY, USA)。方 法构建表达shRNA 慢病毒载体选择GeneBank 中人PRL-3 基因编码区序列(NM-032611)作为分析序列。设计、合成4对针对PRL-3 基因siRNA 的寡核苷酸序列,使用BLAST (Basic l
12、ocal alignment search tool)将选择的干扰序列和相应的基因组数据(人、小鼠、大鼠等)进行序列比对,确信所选序列与其他的基因不具有同源性。分别构建各干扰序列的表达质粒,转染293T 细胞,据其对PRL-3 基因的抑制率,确定最有效靶序列为:5-GCTCACCTACCTGGAGAAA-3,设计并合成(上海吉凯基因化学技术公司)其siRNA 的DNA Oligo:5-CCGGCAGCTCACCTACCTGGAGAA ATTCAAGAGATTTCTCCAGGTAGGTGAGCTGTTTTTG-3。阴性对照的核心序列为5-TTCTCCGAAC GTGTCACGT-3,以下称为NC
13、 序列,其DNA Oligo: 5-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTT CAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT-3。寡核苷酸经退火形成双链DNA,经T4 连接酶与Age和EcoR双酶切后的pGCL-GF 线性化载体连接,形成表达shRNA 的重组慢病毒质粒载体,并行酶切鉴定。用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞,转化DH5 大肠杆菌,挑取重组阳性克隆行PCR 筛选,并作测序分析(上海吉凯基因化学技术有限公司)。PCR 鉴定阳性克隆的引物:上游引物:5-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3;下游引物:5-GTAATACGGTTATC
14、CACGCG-3。慢病毒包装及滴度测定以Qiagen 公司的质粒抽提试剂盒对慢病毒包装系统中3种质粒即:表达最有效靶序列siRNA 的重组慢病毒质粒载体pGC-LV,pHelper ,及pHelper ,分别进行高纯度无内毒素DNA抽提,质粒DNA 溶于除菌的TE 中,以紫外光吸收法测定其浓度及纯度,保证所提质粒DNA的A260/A280在 之间。按Invitrogen 公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T 细胞,转染后8 h 更换为完全培养基,培养48 h 后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,以293T 细胞GFP 蛋白的表达
15、水平经孔稀释法测定病毒滴度。SMCC-7721细胞分组及感染细胞分为3组: SMCC771-CON,空白对照组(CON),未感染慢病毒的细胞;SMCC7721-NC,阴性对照组(NC),即阴性对照慢病毒LV-PRL3-SiRNA-neg 感染的细胞组;SMCC7721-KD,基因敲除组(KD),被RNAi靶点病毒LV-PRL3-SiRNA 感染的SMCC7721 细胞。处于对数生长期的靶细胞进行胰酶消化,制成细胞悬液将细胞悬液(细胞数约为2 104)接种于12孔板中, ,体积分数为5% CO2培养箱培养,待细胞融合度达到约30%,根据MOI 值,按实验设计的组别分别加入RNAi 慢病毒颗粒进行
16、目的细胞的感染实验。待感染时间达到5 d后收集细胞抽提RNA 及蛋白分别进行Real time PCR 及western blot 检测实验,进而判断靶点的干扰效果。Real time PCR 收集上述3组SMCC-7721 细胞,用PBS 洗3次,按照试剂盒操作手册提取提总RNA,用紫外分光光度法定量RNA。将等量的RNA反转录为cDNA第1链。SYBR Prime Script RT-PCR Kit(两步法)反转录反应条件 15 min, 5 s。PRL-3上游引物:5-GATGGC ATCACCGTTGTGGA-3,下游引物:5-CGTACTTC ATCCCGCTCTCAAT-3,以-a
17、ctin 基因为内对照,上游引物:5-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3,下游:5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。将PCR 反应液加入Real Time PCR用反应管中: 15 s,1个循环; 5 s、 30 s,45个循环。定量的方法以2-Ct (Ct代表循环阈值)表示基因的表达量,以加阴性对照病毒 LV-PRL3-SiRNA-neg感染的细胞为对照细胞,公式Ct = (Ct(target gene) - Ct(-actin)感染细胞 - (Ct(target gene) - Ct(-actin)对照细胞,以上实验重复3次。Western blot 细胞收集后
18、加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂PMSF,冰上孵育30 min, 4 14 000 g, 30 min 离心,将上清移至一新的EP 管中,Bradford 法测定蛋白质浓度,并分装。取20 g蛋白质,与2 SDS 上样缓冲液1 1混合,沸水煮10 min,置冰上2 min,行12% SDS-PAGE 电泳。电泳完毕后,PAGE 胶上的蛋白质用Bio-Rad微型电转移系统于4 、100 mA 电转移 h至PVDF 膜上。PVDF 膜用20 mL 封闭液(含50 g/L脱脂奶粉的TBST) 室温孵育1 h,倒去封闭液,加入兔抗人PRL-3多克隆抗体(1:1 000 稀释) 4 孵育过夜, 25 m
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 浅论慢 病毒 靶向 PRL
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【天****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【天****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。