GdCl3对小鼠肝脏再生早期Cyp7A1基因转录的影响.docx
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1、GdCl3对小鼠肝脏再生早期Cyp7A1基因转录的影响【摘要】 目的: 探讨小鼠肝脏再生早期氯化钆(GdCl3)通过作用于枯否细胞影响胆酸介导的Cyp7A1基因转录的抑制. 方法: 运用GdCl3 (10 mg/kg, iv.) 或PBS ( mL, iv.) 处理C57BL/6小鼠24 h后,切除小鼠70%的肝脏,于术后第1日处死小鼠,收集肝脏,采用实时定量RTPCR方法检测肝脏中Cyp7A1, TNF和IL6基因的表达. 结果: 肝脏再生的第1日, 与PBS对照组相比, GdCl3处理组中Cyp7A1 mRNA 的表达降低(), 而细胞因子TNF和IL6 mRNA 的表达升高 (). 结论
2、: 在肝脏再生的早期, GdCl3可增进胆酸介导Cyp7A1基因转录的抑制, 这种作用是通过促使枯否细胞产生细胞因子TNF 和IL6来实现.【关键词】 GdCl3;枯否细胞;细胞因子类;Cyp7A1基因;肝再生Effect of gadolinium chloride on Cyp7A1 gene transcription during early stages of mouse liver regeneration 【Abstract】 AIM: To observe the effect of gadolinium chloride (GdCl3 ) on Kupffer cells r
3、egarding the bile acidmediated suppression of Cyp7A1 gene transcription during early stages of the mouse liver regeneration. METHODS: Twenty four hours before 70% hepatectomy, C57BL/6 mice were treated with either GdCl3 (10 mg/kg, iv) or PBS ( mL, iv). Mice were sacrificed at the first day after sur
4、gery. Livers were harvested and Cyp7A1, TNF , IL6 gene expressions were measured by realtime RTPCR. RESULTS: During the first day of liver regeneration, compared to the PBS pretreated mice, the Cyp7A1 gene expression was dramatically decreased (). In contrast, the TNF and IL6 gene expressions were s
5、ignificantly increased in GdCl3 pretreated mice (). CONCLUSION: During the early stages of liver regeneration, the enhanced effect of the bile acidmediated suppression of Cyp7A1 gene transcription by GdCl3 is via its stimulation of cytokine production from Kupffer cells. 【Keywords】 GdCl3; Kupffer ce
6、lls; cytokines; Cyp7A1 gene; liver regeneration 0引言 胆固醇在肝脏内代谢为胆酸是胆固醇从体内清除的重要方式. Cyp7A1基因编码胆固醇转化成胆酸过程中的限速酶胆固醇7羟化酶. 胆酸可通过多种机制来反馈抑制Cyp7A1基因的表达1. Miyake 等2研究发现当胆酸在肝脏内达到一定浓度时,会诱导枯否细胞合成并释放细胞因子. 这些细胞因子作用于肝细胞后,可导致Cyp7A1基因表达的抑制. 通过调控Cyp7A1基因的表达来保持胆酸代谢的平衡是小鼠肝脏部分切除术 (partial hepatectomy, PH) 后正常再生的重要条件. 氯化钆(ga
7、dolinium chloride, GdCl3) 是一种稀有的地球金属,它可以破坏肝脏枯否细胞的功能,因此常被用来研究与枯否细胞相关的疾病或毒性过程的发生机制. GdCl3的作用效应目前还有争议. 本研究探讨在小鼠70%PH术后再生的早期,GdCl3影响枯否细胞参与胆酸负反馈抑制Cyp7A1基因表达的过程. 1材料和方法 材料雄性,出生810 wk的C57BL/6小鼠36只,体质量2226 g;GdCl3;TRI试剂 ,溴氯丙烷(美国Molecular Research Center公司);异丙醇 , 二乙基焦磷酰胺(美国 Sigma公司 ); MMLV 逆转录酶(美国Invitrogen公
8、司);重组核糖核酸酶抑制剂(美国Promega公司);SYBRGreen PCR Master Mix,7300 实时定量PCR 系统(美国Applied Biosystems公司);Polytron PTMR2100匀浆器 (美国Lyophiler/polytron );CS6R低温离心机,640B分光光度计(美国Beckman). 方法 动物实验实验动物随机分为未行手术而仅给予PBS静注组和70% PH术后PBS对照组(C组)三组,每组动物各12只.A组仅给予小鼠尾静脉注射PBSmL; B,C两组分别于70% PH术前24 h, 小鼠尾静脉注射GdCl3 10 mg/kg或注射PBSmL.
9、 行70% PH手术的小鼠,其肝脏的左外叶,尾叶和中叶将被完全切除,胆囊保持完整无损. 于术后第1日,将三组小鼠全部处死,收取肝脏,在液氮中速冻后保存于-80冰箱备用. 小鼠肝脏总RNA的抽提和cDNA的合成取100 mg肝脏组织,在TRI试剂中匀浆后,根据说明书的方法进行RNA抽提. 取3 g RNA,以oligodT为引物,在20 L反应体系65预变性10 min后, 再加入5xFS Buffer,/L DTT, 25 mmol/LdNTP, Rnasin和MMLV至反应体系30 L , 42 1 h. 实时定量PCR应用7300 SYBRGreen实时定量PCR系统定量检测小鼠肝脏中Cy
10、p7A1, TNF和IL6基因 的表达. 使用的正向引物 和反向引物包括Cyp7A1 (F) CAAGAACCTGTACATGAGGGAC; Cyp7A1 (R) CACTTCT TCAGAGGCTGCTTTC; TNF ( F) TGTCTACTGA ACT TCGGGGTGATC; TNF ( R) GGTTGTCTTTGAGATCC ATGCCGT; IL6( F) TTCCTCTGGTCTTCTGGAGTAC; mIL6 (R) CCTTCTGTGACTCCAGCTTATCPCR 反应体系为20 L: SYBR Green PCR Master Mix 10 L, cDNA 5 L,
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