外周血PSA、PSA-mRNA联合检测在前列腺癌诊断中的临床应用.docx
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1、外周血PSA、PSA mRNA联合检测在前列腺癌诊断中的临床应用【摘要】 目的 探讨利用外周血PSA、PSA mRNA联合检测诊断前列腺癌的临床应用及意义。方法 运用酶联免疫分析和巢式RTPCR检测22例PCa、10例良性前列腺增生患者,5例健康男性和5例健康女性外周血中PSA、PSA mRNA的情况。结果PCa患者血清PSA的水平与临床分期、Gleason评分有关,而与年龄无关;外周血PSA、PSA mRNA与临床分期、内分泌治疗有关,而与年龄、Gleason评分无关;22例PCa标本中PSA mRNA阳性表达15例,阳性率68%,10例BPH和10例阴性对照标本无表达。结论 利用外周血PS
2、A、PSA mRNA联合检测是一种早期发现PCa微转移,判断其临床变化过程、分期、预计复发和评价疗效的方法。【关键词】 前列腺特异抗原;前列腺癌;前列腺增生;逆转录聚合酶链式反应临床上大约有50%的前列腺癌(PCa)病人在确诊时就已经发生了转移,病变已属晚期,预后不良13。国外报道血清游离PSA与外周血PSA mRNA联合检测PCa在鉴别良、恶疾病上有一定优越性4,5。国内这方面报道较少。应用RTPCR技术检测外周血中存在的少量癌细胞,可以发现微转移,对肿瘤的复发、转移、预后及临床治疗具有指导意义6,7。本研究采用酶联免疫技术和巢式RTPCR技术联合检测外周血PSA和PSA mRNA,以提高P
3、Ca微转移的诊断效率、监测复发、预测肿瘤分期及预后。1 材料与方法11 病例资料PCa组:选择20052006年佳木斯大学附属第一医院、佳木斯市中心医院门诊和住院病人。22例均为初诊PCa患者,均经前列腺穿刺病理诊断,年龄6482岁,平均72岁。22例PCa患者中有15例接受了内分泌治疗,7例未接受。BPH组:10例均为行前列腺经尿道电切术后病理证实患者,年龄3481岁,平均65岁。阴性对照组:5例男性健康志愿者和5例女性健康志愿者,血液学指标均正常,年龄2545岁,平均38岁。12 仪器及材料Ficoll淋巴细胞分离液购自中国医学科学院天津血液病研究所,总RNA提取RNAiso试剂盒、两步法
4、RTPCR试剂盒购自大连生物工程有限公司,引物由上海生物工程服务技术有限公司合成,PSA定量试剂盒购自美国博检生物试剂有限公司。Biometra Tg PCR 仪:华粤企业集团有限公司;DU800核酸蛋白分析仪:Beckman公司;免疫分析仪器:DNM9602G型酶标分析仪。13 引物序列PCR引物:外引物:PSA494:5TACCCACTGCATCAGGAACA3;PSA960:5CCTTGAAGCACACCATTACA3。内引物:PSA559:5ACACAGGCCAGGTATTTCAG3;PSA894:5GTCCAGCGTCCAGCACACAG3。actin 上游:5CGGGAAATCGT
5、GCGTGACAT3;下游:5GAACTTTGGGGGATGCTCGC3。扩增目的片段长度为712 bp。14 血清的提取抽取空腹静脉血5 ml,立即2 000 r/min离心10 min,分离血清置-20保存,1 w内完成实验。15 外周血单个核细胞的提取抽取5 ml静脉血肝素抗凝,用Ficoll淋巴细胞分离液分离白细胞置-80冰箱保存,提取过程按其说明书操作。16 总RNA的抽提及质量鉴定用Trizal试剂提取总RNA,提取过程按其说明书操作。提取产物用12%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。紫外分光光度计下测OD260、OD280,测定RNA纯度和浓度。取OD260/OD280值在
6、1820范围内的标本进行逆转录。所有实验中的塑料制品及实验用具均经01%DEPC水处理后高压灭菌。17 RTPCR取1 g总RNA进行逆转录反应;取逆转录产物2 l和PSA上下游外、内引物各1 l,使用20 l反应体系进行2次PCR,同时扩增PSA、actin和阴性对照cDNA。具体循环参数为:94 4 min,94 45 s,55 30 s,72 45 s;25个循环之后,72延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用EB染色,经凝胶成像系统拍照。18 血清PSA的检测PSA定量检测由专人严格按说明书进行操作。19 统计学处理应用SPSS100软件对数据进行处理,采用t检验、2
7、检验。2 结果21 PCa组、BPH组、阴性对照组血清PSA检测结果 见表1。表1 PCa组、BPH组、阴性对照组血清PSA的检测结果22 PCa组血清PSA检测结果与临床参数的关系见表2。表2 PCa组血清PSA与临床参数的关系(略)PCa组血清PSA的水平在3个年龄分组中总体比较无显着性差异,在3个临床分期中总体比较有显着性差异,在3种Gleason评分中总体比较有显着性差异。23 PCa组、BPH组、阴性对照组外周血PSA mRNA表达情况PCa病人外周血标本经PSA巢式PCR外、内引物两次扩增后,产物在同一琼脂糖上得到PSA的RTPCR特异性条带。PSA经巢式PCR扩增最终可得到特异性
8、条带。PCa组、BPH组、阴性对照组外周血PSA mRNA表达情况见表3。表3 PCa组、BPH组、阴性对照组外周血PSA mRNA表达情况 PCa组PSA mRNA阳性表达明显高于BPH组,差异有显着性意义。24 PCa组外周血PSA mRNA表达情况与临床参数的关系见表4。表4 PCa组外周血PSA mRNA表达情况与临床参数的关系 PSA mRNA表达情况在3个年龄分组中总体比较差异无显着性,在3种Gleason评分中总体比较无显着性差异,在3种临床分期中总体比较差异有显着性,在是否内分泌治疗分组中总体比较差异有显着性。 17泳道为第1次PCR阳性结果,长度为466 bp;814泳道为第
9、2次PCR阳性结果,长度为335 bp;15泳道为 DL2 000 Maker3 讨论 目前对PCa诊断的方法主要有直肠指检、影像学、针吸细胞病理学、前列腺穿刺活检以及PCa肿瘤标志物PSA检测等。而这些方法很难诊断PCa的早期转移,因此人们努力寻找能早期发现肿瘤,监测微转移的方法。转移是恶性肿瘤的一个重要标志,是肿瘤术后复发、放疗和化疗失败的主要原因,也是肿瘤患者治愈率得不到提高的主要影响因素。许多肿瘤在淋巴结、外周血、骨髓中微转移灶的检出对肿瘤的诊断、分期、复发和预后的判断、手术、综合治疗的选择具有明显的指导意义8。 PSA是一种独特的酶9,是由前列腺上皮细胞分泌的糖蛋白10,是前列腺上皮
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