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RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响【关键词】 RNA干扰；ERCC1基因；卵巢癌；耐药摘要：目的：观察RNA干扰沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞耐药的影响。方法：体外合成靶向于ERCC1基因的小干扰RNA(ERCC1-siRNA),用脂质体法转染至卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP,RT-PCR方法检测转染前后细胞内ERCC1 mRNA的表达，Western blot方法检测ERCC1基因蛋白表达的改变，MTT实验检测转染前后COC1/DDP细胞对顺铂敏感性的变化。结果：转染ERCC1-siRNA后，COC1/DDP细胞中ERCC1基因的mRNA和蛋白表达均明显减少。RNA干扰联合顺铂用药能明显提高COC1/DDP细胞对顺铂的敏感性。结论：RNA干扰ERCC1基因能明显抑制COC1/DDP细胞内ERCC1基因mRNA和蛋白的表达，增加COC1/DDP细胞对化疗药顺铂的敏感性。关键词： RNA干扰； ERCC1基因； 卵巢癌； 耐药Effect on Cytotoxicity by RNAi ERCC1 Gene Expression in Ovarian Cancer CelI LineAbstract： Objective:To study the effect on drug resistance by RNAi mediated ERCC1 gene silencing in ovarian cancer cell line. Method:Small interference RNA targeted ERCC1 gene was synthesized in vitro and was transfected into COC1/DDP cell The expression of ERCC1 was detected by semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blot .MTT test were applied to measure the inhibition combined with cisplatin of COC1/DDP strainResult：After transfection of ERCC1-siRNA,mRNA and protein levels of ERCC1 gene in COC1/DDP cells were obviously reduced；ERCC1 gene combined with cisplatin increases the sensitivity to chemotherapyConclusion: ERCC1-siRNA could reduce the expression of ERCC1 gene and increase the sensitivity to cisplatin in COC1/DDP cell.Key words： RNAi; ERCC1 gene; Ovarian cancer; Drug-resistance卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其5年生存率仅为20%30%。治疗的难点为卵巢癌细胞对化疗药物尤其是一线化疗药顺铂产生耐药性，严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应。ERCC1基因是核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER) 基因家族成员之一，与卵巢癌化疗耐药密切相关1。ERCC1基因表达上调是卵巢癌顺铂耐药的重要原因。RNA干扰技术是近10年出现的一种研究基因功能和进行基因治疗的一种新方法，是外源双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平沉默靶基因，阻断基因的表达2。由于RNAi具有序列特异性和高效性，目前已成为抗肿瘤基因治疗的有效手段。本研究根据ERCC1基因高表达于卵巢癌耐药细胞以及RNAi高效特异抑制目的基因的特点，针对ERCC1基因设计合成小干扰RNA，在脂质体的介导下转染人卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP，以RT-PCR及Western blot方法检测RNA干扰前后细胞内ERCC1基因mRNA及蛋白表达水平的改变。采用MTT实验检测RNA干扰ERCC1基因后卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP对顺铂敏感性的改变，以探讨逆转卵巢癌化疗耐药的新方法。1 材料与方法1 材料与试剂：卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP购自中国典型培养物保藏中心。RNA干扰试剂盒购自美国Ambion公司。阳离子脂质体转染试剂盒Lipofectamine 2000、Trizol RNA提取试剂盒、M-MLV逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清购于GIBCO公司。ERCCI鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠IgG-HRP、Actin(119)多克隆抗体SANTA CRUZ公司。2 细胞培养：COC1/DDP细胞常规培养于含10胎牛血清，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，37 、5CO2孵箱培养。在培养过程中加顺铂1mg/L以维持耐药性，实验前3d停药。3 小干扰RNA的构建：根据siRNA设计原则和GeneBank中ERCC1基因的编码序列，选择以AA开始长21nt的核苷酸序列为反义模板，与之互补链为正义模板 ，两者3端均加上T7启动子引物，序列为：5CCTGTCTC 3。ERCC1-siRNA模板序列的两条链分别为5AAGGAAGAAATTTGTGATACCCCTGTCTC 3和5AAGGTATCACAAATTTCTTCCCCTGTCTC 3。两条链经体外转录合成dsRNA。4 siRNA的转染：细胞接种于含10胎牛血清、50Uml青霉素、50mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置37 、5CO2培养箱孵育，实验前无药培养3d。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为105ul，接种于24孔板中(每孔500ul)，用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000,按试剂盒说明进行操作，转染ERCC1- siRNA后48h收集细胞做以下实验。5 半定量RT-PCR 检测转染前后COC1/DDP细胞中ERCC1 mRNA的表达：从未转染和转染48h后的细胞中提取细胞总RNA，按逆转录(RT)试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。聚合酶链(PCR)反应，上游引物:5TCGATCCCTCTGCAGTCTTT 3,下游引物:5ATTGCGCACGAACTTCAGTA 3，扩增片段约为447bp。PCR反应体系50ul，反应条件：预变性945min，94 变性30s，60 退火40s，72延伸40s，30个循环，末次延伸10min。实验以GAPDH为内参照，其上游引物:5TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGG 3，下游引物：5CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC 3,扩增片段约为983bp。具体操作过程参照说明书进行，扩增产物在2的琼脂糖凝胶中电泳观察。6 Western blot检测细胞内ERCC1蛋白水平的变化：转染后48h收集细胞，蛋白上样缓冲液裂解细胞，提取总蛋白，紫外分光光度计法进行蛋白定量。40g蛋白进行15SDS-PAGE凝胶电泳，以蛋白电泳转移仪将产物转至NC膜上，室温封闭2h。加入1：1 00 ERCC1鼠抗人单克隆抗体，4反应过夜，PBS洗膜，加入1：1000羊抗鼠IgGHRP，室温孵育2h，化学发光试剂反应5min，发光成像仪取像。7 MTT试验：取对数生长期细胞，脂质体转染6h后，每孔细胞加入20ul不同浓度的DDP继续培养，对照组加无血清、无抗生素的培养基，每个药物浓度设3个复孔。转染48h后，每孔加入20ul浓度为5mg/ml的MTT，4h后离心，加入DMSO 100ul，震荡后置酶标仪546nm处测定吸光度值。8 统计学分析：采用SPSS110 for windows统计软件处理，采用t检验。2 结果ERCC1-siRNA的鉴定和定量：合成的ERCC1-siRNA经12%丙烯酰胺凝胶电泳可见一条21-21bp的双链RNA条带。将合成的siRNA稀释后测定260nm的吸光度值，提示合成的siRNA产量在40110ug之间。应用RT-PCR法检测RNA干扰前后COC1/DDP细胞中ERCC1基因的转录水平(图1)。各组细胞在相对于447bp的位置均可见ERCC1基因电泳带存在，但其亮度存在明显差异，干扰组电泳带亮度明显弱于非干扰组。图1 半定量RT-PCR检测转染ERCC1-siRNA前后COC1/DDP细胞中ERCC1 mRNA表达图1：M为分子量Marker,泳道1为转染后ERCC1mRNA的表达，2为转染后ERCC1mRNA的表达，3、4为-actin对照转染ERCC1-siRNA后细胞中ERCC1蛋白的表达：采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测COC1/DDP细胞中ERCC1基因蛋白的表达(图2)，结果显示在位于36KD处出现ERCC1特异性蛋白杂交带，但转染前后条带亮度有明显差异，其中RNA干扰组细胞的蛋白条带亮度明显低于对照组。图2 Western blot检测转染ERCC1-siRNA前后COC1/DDP细胞中ERCC1蛋白的表达MTT实验：转染ERCC1-siRNA后，卵巢癌细胞COC1/DDP对化疗药物顺铂的敏感性增强，IC50值在干扰前为/ml, 干扰后为 /ml；IC50值在干扰后比干扰前下降倍，两者相比差异具有显着性(P005)。3 讨论 RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近年来发现的一种重要基因沉默现象,是存在于真核生物体内的一种自我保护现象,能对抗外源导入或病毒基因所表达的mRNA等外源基因的侵害，也能降解自身异常基因产生的mRNA3。高效特异的阻断基因的表达是RNAi的一大特征。在线虫、果蝇体内RNAi能达到基因敲除的效果，在小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术也成功的阻断了基因的表达,实现了细胞水平的基因敲除4。ERCC1基因是核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER) 基因家族成员之一，与肿瘤化疗耐药密切相关。多相研究表明，ERCC1基因表达上调是卵巢癌顺铂耐药的重要原因5，6。因此，以ERCC1为靶基因的靶向治疗以逆转肿瘤的耐药，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性成为卵巢癌治疗的新途径。本研究根据ERCC1基因高表达于卵巢癌耐药细胞以及RNAi高效特异抑制目的基因的特点，针对ERCC1基因mRNA设计小干扰RNA，采用体外合成的方法合成dsRNA，将其转染至卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP，用RT-PCR和Western blot方法分别在mRNA及蛋白水平检测ERCC1基因表达，结果显示ERCC1-siRNA能有效干扰ERCC1基因的表达，阻断mRNA向蛋白质的信息传导，进而达到对目的基因的抑制作用。结果与文献报道相一致7。MTT实验显示了转染ERCC1-siRNA后，COC1/DDP细胞对顺铂的反应性明显增强，提高了化疗药物对肿瘤细胞生长的抑制作用，部分逆转了COC1/DDP细胞对顺铂的耐药。证实了RNA干扰技术在肿瘤基因治疗领域的作用。由于RNA干扰技术具有特异、高效抑制靶基因表达的特性，因而成为抗肿瘤基因治疗的新方法，在肿瘤基因治疗领域显示了诱人的前景。但由于肿瘤细胞产生耐药机制具有复杂性，因此，需要进行更深入的研究以观察RNAi逆转肿瘤细胞耐药的疗效。参考文献：1 Britten RA，Liu D，Tessier A，etexpression as a moleculax marker of cisplatin resistance in human cervical tumor cellsJ. 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