孕激素和米非司酮对子宫内膜癌HHUA细胞的作用.docx
《孕激素和米非司酮对子宫内膜癌HHUA细胞的作用.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《孕激素和米非司酮对子宫内膜癌HHUA细胞的作用.docx(16页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
孕激素和米非司酮对子宫内膜癌HHUA细胞的作用 【摘要】 目的 探讨孕激素和孕激素受体拮抗剂米非司酮对人子宫内膜癌HHUA细胞株的生长抑制作用及对其表达凋亡蛋白的影响。方法 体外培养人子宫内膜癌HHUA细胞,不同浓度孕激素和米非司酮分别作用于细胞72h,绘制细胞生长曲线计算半数有效浓度后,分为对照组、孕激素组、米非司酮组、孕激素和米非司酮联合组,以各药物的IC50干预细胞48h后,用MTT法计算细胞抑制率,免疫组化S-P法测定各组细胞bcl-2和Fas蛋白表达的变化。结果 MTT实验表明,孕激素和米非司酮均能抑制子宫内膜癌细胞增殖。孕激素半数有效浓度为μmol/L;米非司酮的半数有效浓度为μmol/L,联合用药组抑制率显着高于单独用药组。孕激素和米非司酮联合可使bcl-2表达下降,Fas表达升高。结论 孕激素和米非司酮联合应用在子宫内膜癌HHUA细胞的抗增殖和干预bcl-2和Fas蛋白的表达方面有协同作用。 【关键词】 子宫内膜肿瘤;孕酮;米非司酮;肿瘤细胞;培养 Effects of progesterone and mifepristone on the human endometrial cancer cell line HHUA 【Abstract】 Objective To study the effects of progesterone and mifepristone on the growth inhibitions and apoptosis protein of human endometrial cancer cell HHUA cells,treated by different concentrations of progesterone and mifepristone were examined for their growth inhibitions with methyl thiazolyl tetrazolium assay after 72 hours and got the inhibitory concentration 50%. HHUA cells,treated by control,progesterone or mifepristone or progesterone combined mifepristone for 48 hours,were examined for their inhibitory rate with MTT and for their bcl-2 and Fas with immunohistochemistry HHUA cells growth was inhibited by progesterone and of progesterone is μmol/L;IC50 of mifepristone is μmol/ inhibitory rate of progesterone combined with mifepristone was obviously stronger than that of progesterone and mifepristone. The expression of bcl-2 was decreased and Fas increased. Conclusion HHUA cells was treated by progesterone combined with mifepristone and synergistic effect was observed on the inhibitory growth and the expression of bcl-2 and Fas. 【Key words】 endometrial neoplasms;mifepristone;progesterone;tumor cells;culture 近20余年来,子宫内膜癌的发病率有上升趋势,且随着发病年龄的年轻化,保留生育能力的治疗方案已成为患者的迫切需求。激素治疗是年轻子宫内膜癌患者的主要保守治疗手段之一,研究显示[1],年轻未育的内膜癌Ⅰ期患者,如果细胞分化好可以考虑保守治疗,同时严密监测有无复发,等待完成生育后再行手术治疗。目前子宫内膜癌激素治疗的主要药物有高效孕激素及三苯氧胺。有研究表明,孕激素受体拮抗剂米非司酮对多种肿瘤细胞具有抑制作用。本实验旨在探索孕激素和米非司酮二者联合对子宫内膜癌HHUA细胞的生长抑制作用,以及该方案对HHUA细胞株表达凋亡蛋白的影响,以期为临床治疗子宫内膜癌提供新方案。 1 材料与方法 子宫内膜癌细胞系 子宫内膜癌HHUA细胞是高分化子宫内膜腺癌细胞,其含有雌二醇受体和孕激素受体以及wt p53、p21等基因,由山东省立医院生殖中心惠赠。 主要试剂和仪器 黄体酮分析纯购自江苏省药物检验所。米非司酮纯品由北京第三制药厂提供。DMEM细胞培养液,小牛血清,四甲基偶氮唑盐,96孔培养板,酶联免疫检测仪。鼠抗人bcl-2、Fas单克隆抗体均为北京中杉公司产品。 细胞的制备 HHUA细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液中置37℃、5%CO2培养箱中培养,每4~5天传代,药品用无水乙醇溶解,并用含小牛血清的培养基稀释到所需浓度,使乙醇终浓度小于1%。 四甲基偶氮唑盐比色实验 绘制细胞生长曲线 取对数生长期HHUA细胞制备成3×104个细胞/ml,混匀后加入96孔细胞培养板,每孔200μl,24h后观察细胞已贴壁,吸弃上清加入含药物的培养基,孕激素的剂量稀释为0、10、20、40、60、80、100、120、140、160μmol/L,米非司酮的剂量稀释为0、5、10、20、40、60、80、100、120μmol/L,空白对照组中加入相等体积不含药物的培养基,每组6个复孔,培养72h,加MTT溶液20μl,继续孵育4h,吸弃上清,每孔加入150μlDMSO,震荡10min,使结晶物充分溶解,选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值,记录结果,按下列公式计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率。抑制率=/AC×100%。 AC为对照组吸光度值,AT为实验组吸光度值。以药物抑制百分率为纵坐标,药物浓度为横坐标,通过直线回归分别计算孕激素和米非司酮抑制50%肿瘤细胞时的有效浓度,以IC50值作为干预细胞的药物浓度。 MTT法检验细胞增殖率 取对数生长期HHUA细胞制备成3×104个细胞/ml分别加入药物:对照组、P组、RU486、P+RU486联合组。每组6个复孔,培养48h后,MTT法检测细胞增殖率。 免疫组织化学法 将处于对数生长期的HHUA细胞制备成1×105个细胞/ml的细胞悬液,在每孔底面铺有洁净小玻片的24孔培养板中每孔加入1ml,24h后待细胞贴壁后加入药物:对照组、P组、RU486组、P+RU486联合组,每个浓度设双孔,培养箱中继续培养48h,PBS冲洗2遍,用丙酮固定细胞玻片5~10min,严格按免疫组化操作程序进行S-P法染色。 染色结果判断 阳性表达为棕黄色颗粒的出现,其中bcl-2定位于细胞浆,fas定位于细胞膜。按AB值法进行光镜分析,A表示显色深浅:0分无显色,1分为浅黄色,2分为棕黄色,3分为棕色;B表示每个高倍镜视野棕色细胞所占比例:1分棕色细胞<1/3,2分棕色细胞1/3~2/3,3分棕色细胞>2/3,共记数5个高倍镜视野。每例细胞阳性表达积分分为四级:“-”积分为0分;“+”积分为1~2分;“++”积分3~4分;“+++”积分>4分。 统计学分析 数据分析采用统计软件,所有数据结果均用x±s表示,组间多个样本均数间比较采用单因素方差分析。 2 结果 绘制细胞生长曲线 两种药物对肿瘤细胞的抑制率均随着药物浓度的增加而变化,存在明显的量效关系,P对HHUA细胞生长抑制的IC50为μmol/L,RU486的IC50为μmol/L。图1 MTT法检测P和 RU486对子宫内膜癌HHUA细胞的抑制作用 孕激素和米非司酮联合对子宫内膜癌细胞的作用 细胞增殖实验显示,孕激素和米非司酮联合作用48h后细胞生长抑制率显着低于单独用药组。 表1 孕激素和米非司酮对人子宫内膜癌HHUA细胞的抑制率注:与对照组比较,*P<;分别与孕激素和米非司酮组比较,△P< 孕激素和米非司酮对凋亡蛋白表达的影响 免疫组化法测定bcl-2和Fas蛋白表达水平显示联合组分别与孕激素组和米非司酮组相比,bcl-2表达均显着下降,Fas表达显着上升。表2 孕激素和米非司酮作用48h Bcl-2,Fas蛋白表达变化 注:与对照组比较,*P<;分别与孕激素和米非司酮组比较,△P< 3 讨论 子宫内膜癌的激素治疗 子宫内膜癌是妇科生殖道最常见的恶性肿瘤之一,目前在许多国家,内膜癌发病率已超过宫颈癌而跃居女性生殖道恶性肿瘤的首位。子宫内膜癌的病因目前尚不十分清楚,大部分研究认为子宫内膜癌最常见的发病高危因素是过量雌激素长期刺激的结果[2],雌激素刺激内膜过度增生,与内膜癌的发生关系密切。针对这一高危发病因素,许多临床和实验研究正积极探索内膜癌的激素治疗途径。目前,子宫内膜癌的孕激素疗法已被认可及应用,文献报道[3]孕激素治疗有效率为20%~25%,主要用于远处转移和复发的内膜癌患者,高分化且孕激素受体阳性的子宫内膜癌患者对激素治疗的反应率高,而雌激素受体拮抗剂三苯氧胺可以提高子宫内膜癌细胞表达孕激素受体。 孕激素对子宫内膜癌的作用 孕激素具有抑制肿瘤细胞增殖、调节细胞基因表达、抑制肿瘤细胞侵袭等作用。本研究中肿瘤细胞抑制实验的结果显示,孕激素对人子宫内膜癌HHUA细胞有很强的抑制作用,IC50为μmol/L。有研究显示孕激素对于孕激素受体阳性表达的子宫内膜癌细胞有生长抑制作用[4]。孕激素抗肿瘤作用机制表现在一方面诱导细胞周期素P21和P27产生,使细胞停滞于G1期[5],另一方面直接作用于内膜样腺癌细胞的血管内皮生长因子的基因转录,抑制内膜癌细胞的血管生成[6]。此外,有实验表明[7]安宫黄体酮可明显抑制MMPs的表达,这可能与孕激素抑制癌细胞浸润转移作用有关。孕激素用于治疗子宫内膜癌已有40多年的历史,对81例病理分期均为G1期的患者治疗结果显示,孕激素治疗后有62例患者出现反应,平均出现时间12周。其中15例病人复发,20例病人经完全治疗后妊娠。 米非司酮对子宫内膜癌的作用 孕激素受体拮抗剂米非司酮,由法国Roussel-Uclaf公司合成,最初在临床主要应用于终止早期妊娠,近年来已有人应用到多种妇科疾病和抗肿瘤治疗,包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑膜瘤、神经胶质瘤及子宫肌瘤[8~10]。RU486可通过抗孕激素、“非竞争性”抗雌激素和孕激素样作用等发挥抗肿瘤作用。本实验结果显示RU486具有很强的抑制肿瘤细胞生长的作用,其IC50为μmol/L。RU486抑制子宫内膜癌的研究虽已取得了一定的进展,但其抗肿瘤作用的分子学机制仍不十分清楚。Schneider等[11]用RU486处理三个子宫内膜癌细胞系,发现癌细胞增殖明显受抑制,并呈剂量依赖性。Aimin等[12]发现RU486能使Ishikawa细胞CASP3表达明显升高,凋亡细胞比率高于坏死,BCL/BAXmRNA比值下降,说明RU486可通过多种途径诱导细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。 孕激素和米非司酮联合对子宫内膜癌细胞的作用 Arango等[13]研究发现孕激素和米非司酮都可有效抑制子宫内膜癌细胞生长,且二者具有协同作用。笔者的研究结果支持这一观点,联合用药组和单独用药组相比,前者对肿瘤细胞生长的抑制率增高,免疫组化结果显示bcl-2表达下降和Fas表达升高,前者和后者相比有统计学意义,表明孕激素和米非司酮联合应用可能增强对凋亡蛋白的调节作用,诱导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤的协同作用。孕激素可抑制NF-KappaB的活性,控制细胞转录因子A20和ABIN-2[14],而Han等[15]研究证实米非司酮能够抑制NF-KappaB抑制物的激活,二者协同可能增强对肿瘤细胞基因转录的控制,促进细胞凋亡。此外,也有文献报道[16],孕激素可刺激内膜癌细胞血管内皮生长因子基因转录,而孕激素与RU486合用可减弱孕激素对肿瘤血管的刺激作用,更好地发挥二者的抗肿瘤活性。【参考文献】 1 Jadoul P,Donnez treatment may be beneficial for young women with atypical endometrial hyperplasia or endometrial adeno Steril,2003,80:1315-1324. 2 Sherman of endometrial carcinogenesis:a multidisciplinary Pathol,2000,13:295-308. 3 Markman therapy of endometrial J Cancer,2005,41:673-675. 4 Dai D,Kumat NS,Wolf DM,et al. Molecular tools to reestablish progestin control of endometrial cancer cell Cell Endocrinol,1999,150:11-21. 5 Dai D,Wolf DM,Litman ES,et inhibits human endometrial carcinoma cell growth and invasiveness:down-regulation of cellular adhesion molecules through progesterone B Res,2002,62:881-886. 6 Mueller MD,Vigne JL,Pritts EA,et activate vascular endothelial growth factor gene transcription in endometrial adenocarcinama Steril,2003,79:386-392. 7 Di NLA,Jobling T,Salamonsen suppresses matrix metalloproteinase production in endometrial Oncol,2003,89:325-333. 8 Ramirez PT,Frumovitz M,Bodurka DC,et therapy for the management of grade 1 endometrial adenocarcinoma:a literature Oncol,2004,95:133-138. 9 Li DQ,Wang ZB,Bai J,et of mifepristone on proliferation of human gastric adenocarcinoma cell line SGC-7901 in J Gastroenterol,2004,10:2628-2631. 10 Sridhar S,Ali AA,Liang Y,et expression of members of the rumor necrosis factor alpha-velated apoptosis-inducing ligand pathway in prostate cancer Res,2001,61:7179-7183. 11 Schneider CC,Gibb RK,Taylor DD,et of endometrial cancer lines by mifepristone .J Soc Gynecol Investig,1998,56:334-338. 12 Aimin L,Juan C,Felix,et of mifepristone on proliferation and apoptosis of Ishikawa endometrial adenocarcinoma cells. Fertil Steril,2005,84:202-211. 13 Arango H,Satyaswaroop P,Cavanagh D,et growth inhibitory effects of onapristone and mifepristone on the Ishikawa human endometrial cancer cell Oncol,1996,62:423. 14 Davies S,Dai DH,Feldman I,et of a novel mechanism of NF-ΚB inactivation by progesterone through progesterone receptors in Hec50co poorly differentiated endometrial cancer cells:induction of A20 and ABIN-2. Gynecol Oncol,2004,94:463-470. 15 Han S,Sidell growth inhibition of human endometrial Cancer cells involves the nuclear factor KappaB Signaling Clin Endocrinol Metab,2003,88:713-719. 16 Mueller MD,Vigne JL,Pritts EA,et activate vascular endometrial growth factor gene transcription in endometrial adenocarcinoma cells. Fertil Steril,2003,79:386-392.- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 激素 米非司酮 子宫 内膜 HHUA 细胞 作用
咨信网温馨提示:
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,个别因单元格分列造成显示页码不一将协商解决,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【天****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【天****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,个别因单元格分列造成显示页码不一将协商解决,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【天****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【天****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。
关于本文