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可行性研究报告新

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2020年4月19日
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辽宁省科技攻关层次计划（JH2）项目可行性研究报告
腰椎间盘退变动物模型的建立及生物技术治疗
贾长青 中国医科大学附属第二医院第一骨外科

一、 项目提出的目的及意义
本课题将依据当前椎间盘退变发生机制的研究进展和进展趋势，以腰椎间盘退变模型为对象，探讨基因治疗的可行性。研究表明，在椎间盘退变的早期在分子水平的基因治疗逐渐显现出其优越性。随着各种途径的深入和完善，椎间盘疾病基因治疗的条件已趋于成熟。本课题设计运用TGF-β1基因修饰腰椎间盘退变模型的骨髓间充质干细胞，经TGF-β1转染体外培养的骨髓间充质干细胞后，将转染成功的干细胞鉴定、筛选、扩增后移植入自体退变的椎间盘中对其进行基因治疗，相类似的实验研究未见报道。该研究，可使现有基因治疗中安全性、稳定性、免疫活性等方面的不足得到不同程度的改进；将是基因治疗椎间盘退变的一条新途径。为临床逆转椎间盘退变，防止腰椎间盘突出症的发生提供理论基础和实验依据。
椎间盘退变是椎间盘突出症及腰腿痛的主要原因。流行病学调查发现，80%的人会经历一次或以上的腰痛，其中5%的人长期受到慢性腰痛的困扰。椎间盘退变是困扰中国人民健康的难题之一，它引起的腰腿痛给病人和社会都造成了沉重的负担。当前，椎间盘退变疾病的治疗主要为保守治疗和手术治疗。保守治疗为当前临床治疗的主要方式，但远期效果不佳。手术治疗后，椎间盘的生物学环境发生改变，相邻节段退变加速。近期效果佳，但远期效果需进一步观察。
近年来，随着分子生物学、遗传学、免疫学、组织工程学的发展及其在临床医学中的应用，在椎间盘退变的早期，针对其分子水平生物治疗的优越性越发显现。然而，从事此类研究的关键步骤之一是椎间盘退变实验动物模型的构建和制备，经过实验干预或自发过程，在实验动物体内模拟并观察分析椎间盘退变的过程，从而为椎间盘退变的病因学研究提供参考依据，进而可对椎间盘退变的生物学治疗进行准确评估。
二、与项目相关的国内外发展概况及市场需求分析
为了椎间盘退变的早期干预与修复，国内外学者做了大量的探索。研究表明，细胞因子能够增加椎间盘局部细胞外基质的合成，缺乏细胞因子或细胞因子合成水平降低会导致髓核内蛋白多糖的降解增加、合成减少，蛋白多糖的绝对量减少，继而引起椎间盘退变。Thompson〔1〕 报道了细胞因子对成年狗椎间盘培养细胞的影响，是最早探索用细胞因子诱导退变椎间盘修复的研究之一。生长因子、巨噬细胞、肥大细胞在受损椎间盘纤维环的修复及技法的椎间盘退变中起重要作用〔2〕。Wenger KH〔3〕等的研究表明，在纤维软骨凋亡中，常压下细胞外基质基因的正调节更关注于一般活动的生物力学重要性，而高压下二种主要胶原的分化调节显示了纤维环在病理力学环境下重塑的能力。Sox9基因是Ⅱ型胶原合成过程中一个重要的转录因子，其在软骨的发育、成熟过程中对Ⅱ型胶原基因表示增强和促使Ⅱ型胶原合成增加的作用已十分明确〔4〕。椎间盘软骨样细胞主要分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）如： MMp-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9〔6、7〕。它们是椎间盘基质的主要降解酶，参与突出椎间盘的自然吸收过程。白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、前列腺素E2(PLE2)能促进其合成；转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、胰岛素样生子因子-1（insulinlike growth factor-1,IGF-1）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）等生长因子抑制其合成〔7-10〕。椎间盘及其环境、细胞和其产物复杂的内部反应、髓核内部合成和分解代谢失衡都直接导致椎间盘的退变，从而为椎间盘基因治疗提供两条不同的途径，即主要选择细胞因子和致炎因子拮抗剂作为基因治疗的目的基因。生长因子在离体间接实验中能使胶原及蛋白多糖的合成增加〔11〕。Nishida〔12〕用腺病毒介导的半乳糖苷酶（Lac-Z）基因进行了体内和体外实验，结果腺病毒载体能高效地将Lac-Z基因转导入髓核细胞，在随后的研究中证明相应蛋白的表示能够持续1年之久。之后不久，在体直接向椎间盘细胞导入治疗基因TGF-β1取得成功〔13〕。Moon〔14〕把患者的椎间盘细胞体外培养后利用Ad/CMV-Lac-Z载体直接转导，转导率100%。腺病毒介导的TGF-β1在随后的研究中也成功地转入体外培养的人椎间盘细胞，其表示及蛋白多糖和胶原的合成都得到增加〔17〕。另有研究表明，组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-1)能够作为一个有效的因子对椎间盘退变的过程进行高效率的调节和修复〔16〕。Sobajima〔17〕指出聚集蛋白聚糖和Ⅸ型的基因更加适合作为向椎间盘中转移的候选基因，延缓或防止椎间盘退变的发生。学者们在对基因治疗椎间盘退变充分研究的基础上，指出了椎间盘疾病未来的研究方向。Masuda〔18〕将组织工程技术应用于椎间盘疾病的治疗，并已取得一定疗效。Ganey〔19〕提出向退变的椎间盘中进行细胞移植，来改进椎间盘退变后细胞数目的减少；Okuma〔20〕也提出用同种异体细胞移植来治疗椎间盘退变。Sakai〔21〕给兔椎间盘退变模型植入有生物学支架作用的干细胞，2周后退变的椎间盘得到一定程度的修复。随着各种途径的深入和完善，椎间盘疾病基因治疗的条件已趋于成熟。
TGF-β1是一种分子量为25kd的双链多肽，生物活性极其广泛。它能促进未分化和分化早期的软骨细胞增殖，刺激Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，而Ⅱ型胶原为髓核细胞的主要胶原。TGF-β1基因是广泛用于多种组织修复的重要基因；该基因序列清楚，便于获得，其基因产物对于腰椎间盘退变作用有大量可靠的实验基础；这些都为本实验的进行提供了有益的参考。有报道〔22，23〕运用TGF-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化取得成功。
综上所述，椎间盘的基因治疗当前仍处于实验研究阶段，有些问题仍需进一步探讨：（1）确定椎间盘退变的相关基因，从基因水平上认识其发病的生物学机制；（2）基因转入及表示的有效性及其调控机制的完善；（3）高效、安全表示载体的选择；（4）基因导入方法的改进；（5）基因治疗中可能产生的副作用。
本项研究，在成功建立异常应力环境下椎间盘退变动物模型后，用 TGF-β1转染体外培养的骨髓间充质干细胞，然后将转染成功的干细胞鉴定、筛选、扩增后移植入自体退变的椎间盘中，用分子生物技术逆转腰椎间盘退变。本研究可使现有基因治疗中安全性、稳定性、免疫活性等方面的不足得到不同程度的改进；本项研究成功后，有望进入临床前研究阶段，将在椎间盘退变治疗方法上开辟一条新途径，其治疗脊柱疾患临床应用前景更为广阔。

参考文献：
1. Thompson JP,Oegema TR Jr,Bradford DS.Stimulation of mature canine intervertebral disc by growth factors.Sping, 1991，16（3）：253～260。
2. Peng B, Hao J, Hou S, Wu W, Jiang D, Fu X, Yang Y；Possible pathogenesis of painful intervertebral disc degeneration. Spine. ，Mar 1;31(5):560-6.
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16. Adam LS,Robert C,Lars G.Gene therapy approaches for intervertebral disc degeneration.Spine, ，29(23):2770～2778。
17. Sobajima S,Kim JS,Gilbertson LG.Gene therapy for degenerative disc discase.Spine, ，11(4):390～401。
18. Masuda K,Sah RL,Hejna MJ.A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by mature bovine chondrocytes: alginate –recovered-chondrocyte (ARC) method.Orthop Res, ，21(1):139～148。
19. Ganey T, Libera J, Moos V.Disc chondrocycyte transpralantation in a canine model :a treatment for degenerated or damaged intervertebral disc.Spine, ，28(23):2609～2620。
20. Okuma M,Mochida J,Nishimura K.Reinsetion of stimulated nucleus pulposus cells retards intervertebral disc degeneration :an vitro and in vivo experimental study.J Orthop Res, ，18(7):988～997。
21. Sakai D,Mochida J,Yamamoto Y.Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen gel to the intervertebral disc :a potential therapeutiec model for disc degeneration.Biomaterals, ，24(20):3531～3541。
22. 郭常安，阎作勤，姚振均.脂质体介导转化生长因之-β1基因修饰骨 髓间充质干细胞成软骨分化.复旦学报（医学版）， ，31（4）：343～346。
23. 霍建忠，陈峥嵘，蒋淳.转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞复合壳聚糖修复兔关节软骨缺损.中华风湿病学杂志， ，9（7）：393～396。

三、主要攻关内容及技术路线（技术可行性分析）
一）、主要攻关内容
依据椎间盘退变发生机制的研究进展，以腰椎间盘退变模型为对象，探讨基因治疗的可行性。研究表明，在椎间盘退变的早期，分子水平的基因治疗逐渐显现出其优越性。随着各种途径的深入和完善，椎间盘疾病基因治疗的条件已趋于成熟。本课题设计运用TGF-β1基因修饰腰椎间盘退变模型的骨髓间充质干细胞，经TGF-β1转染体外培养的骨髓间充质干细胞后，将转染成功的干细胞鉴定、筛选、扩增后移植入自体退变的椎间盘中对其进行基因治疗，相类似的实验研究未见报道。该研究，可使现有基因治疗中安全性、稳定性、免疫活性等方面的不足得到不同程度的改进；为临床逆转椎间盘退变，防止腰椎间盘突出症的发生提供理论基础和实验依据。

二）、技术路线
一、异常应力环境兔腰椎间盘退变模型的建立及分组：
1. 兔腰椎间盘退变模型的建立：速眠新0.3ml/kg肌注，麻醉后家兔取俯卧位固定于兔台上，备皮后消毒。以L5为中心取后正中切口长约12cm，在L4，5水平切断双侧竖棘肌。完整咬掉L4，L5，L6两侧关节突关节，止血后逐层缝合，和对照组同等条件下喂养6个月，MR证实L4.5,L5.6间隙发生退行性变(贾长青等。腰椎间盘退变模型的建立及影像学观察。解剖学杂志。 ，27（3）：236-238)；
2. 兔腰椎间盘退变模型的分组：实验组，对照组；
二、 骨髓间充质干细胞的采集和培养：
1. 麻醉后自兔双股骨远端穿刺，用含有肝素-DMEM的注射器抽取骨髓0.2ml，置于短试管中，重复冲洗，然后置于含有Percoll工作也的试管中，使骨髓-DMEM液与分离液的比例为1:1；水平离心，抽取单个核细胞层细胞；用DMEM稀释，调整细胞浓度为1×106/ml；接种于培养瓶内培养；1-2周后进行鉴定；
2. 骨髓间充质干细胞的鉴定：
1） 细胞形态学特征（光镜、电镜观察）；
2） 细胞组织化学特征（Ⅰ型胶原表示、糖原染色、脂肪染色、碱性磷酸酶染色）；
三、 组真核表示质粒pcDNA3-TGF-β1的构建和鉴定
EcoRⅠ酶切pcDNA（invitrogen公司）和TGF-β1基因(华美公司)，分别回收线性pcDNA载体和TGF-β1片段，前者以碱性磷酸酶处理后再与后者相连接构建重组质粒，以EcoRⅠ和KpnⅠ酶切鉴定和筛选转录方向正确的重组体，命名为pcDNA3-TGF-β1。
四、TGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞 和鉴定
⒈ 取骨髓间充质干细胞传代于6孔板中，37℃，5%CO2培养至细胞融合至90%～95%时进行转染。250ulOpti-MEM培养液中加入10ul Lipofectamine 混匀，另在250ulOpti-MEM培养液中加入4ug真核表示质粒（pcDNA3、pcDNA3-TGF-β1），混匀，将两者混匀室温放置20min，将Lipofectamine和真核表示质粒混合液缓慢加入6孔板中，边加边摇动，37℃，5%CO2培养6h后弃混合液，加入2ml完全培养液培养，24h后以1:10传代，36h后改用含有400ul/ml的G418完全培养液培养，2W后G418浓度降至200ug／ml，筛选21d后克隆形成，将其挑至24孔板，生长至融合转移至6孔板，最后转至50ml培养瓶中。
⒉ 转染后的鉴定:经RT-PCR检测,证实TGF-β1目的基因已成功转染至骨髓间充质干细胞
⒊ TGF-β1基因表示的检测：利用Western blot方法检测转染后的骨髓间充质干细胞,证实骨髓间充质干细胞持续表示TGF-β1蛋白质.
五、 观察转染的骨髓基质干细胞移植入退变椎间盘后的TGF-β1表示及椎间盘的修复情况
⒈分组:实验组:移植TGF-β1目的基因转染的骨髓间充质干细胞
对照组:移植未经TGF-β1目的基因转染的骨髓间充质干细胞
2．干细胞自体移植：动物麻醉后后正中切口L4.5为中心，将浓度104-106个/ml细胞液在X线监视下由椎间盘侧方注入髓核内
3．疗效的评估:移植细胞后1、3、6个月 ,组间对照,测量指标如下:
⑴.基因治疗的稳定性的观察:利用RT-PCR和Western blot的方法检测不同时间的TGF-β1的mRNA及其产物的表示情况 .
⑵ 退变椎间盘的修复情况的观察:
①蛋白多糖含量的检测.
②椎间盘细胞增殖情况的检测: MTT法测量细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞的增殖周期.
⑶退变间盘注入转染细胞后的形态学观察：光镜、透射电镜的观察.

四、 现有工作基础和条件

1、 工作基础：本项目负责人1997年起从事椎间盘退变与脊柱疾病的应用基础和临床研究，期间承担省级课题2项， 起建立异常应力下椎间盘退变动物模型，并对椎间盘退变、营养途径、细胞凋亡等方面进行了实验性研究，并已在核心杂志发表与本项目相关论文9篇（第一作者）。
2、 中国医科大学所具备的主要实验平台有国家教育部重点实验室—呼吸疾病研究所，卫生部重点实验室——细胞生物学实验室（23618703），辽宁省转基因和基因敲除单位实验中心等，向全校开放，设备可随时预约使用。当前拥有的仪器设备如下：
超声多普勒仪（美国）
DNA扩增仪（UNOI248 BIOMETRAGER 德国）
核酸电泳仪（DYYI2E-6B 北京）
高速冷冻离心机（STRATOS KENDRO，美国）
HPLC蛋白纯化装置（MAPS-100，美国）
膜片钳装置（AXON1-D，美国）
共聚焦激光扫描显微镜（TCS-SP2，LEICA，德国）
蛋白电泳仪（MINI-PROTEIN Ⅱ，BIO-RAD，美国）
恒冷箱切片机（JUNG CM1800，LEICA，德国）
振动切片机（LANCER VIBRATOM SERIES 1000，美国）
离心机（EPPENDROF CENTRIFUGE 5417C，美国）
生物反应发生器（Synthecon，美国）
实时显微图像分析仪（LUZEX-F，日本）
CO2细胞培养箱（NAOCO，MODEL 5410）
超净工作台（SW-CJ-IF，苏州）
生物倒置显微镜（Nicon TMS-F No.301649，日本）
透射电子显微镜（JEM-1200EX，日本）
万能显微镜（Olympus Bx60/PM30，日本）
X射线能谱分析仪（JEM-1200EX，日本）
超薄切片机（ultracut-E，Rechert-Jung，奥地利）
流式细胞仪（FACSCAN 美国）

五、申请人基础条件
1、 课题负责人简介
贾长青，男，43岁，医学博士，副教授，硕士研究生导师，辽宁省、沈阳市医疗事故技术鉴定专家，本课题负责人。1988年7月中国医科大学本科毕业，1993年7月中国医科大学附属二院获硕士学位， 7月中国医科大学解剖与组织胚胎学专业博士毕业。

科研工作：
研究方向为椎间盘退变与脊柱疾病的应用基础与临床研究。
承担辽宁省自然科学基金1项（972239），辽宁省科技攻关项目1项（9925007）。
当前指导研究生11名。
完成论文20篇，其中核心文章12篇，BA引用2篇

申请者发表与本项目有关的主要论著目次和获奖情况：
1. 贾长青，王臣，陈勇。基质金属蛋白酶-3和血管内皮生长因子自不同月龄大鼠椎间盘组织中的表示和意义。 ，15（3）：355-360
2. 贾长青，王臣，陈勇等。MMP-3和IL-1在突出的腰椎间盘组织中的含量及其相关性研究。中国修复重建外科杂志， ，12月（待发表）
3. 贾长青，柏树令，朱小兵。实验性脊柱内固定后相应区域椎间盘超微结构观察。中国修复重建外科杂志。 ，19（4）：295-298
4. 田伟、贾长青、柏树令。骨重组AECM和Wistar鼠成骨细胞体外联合培养的实验研究。解剖学报 ，36（3）：314-317
5. 贾长青，柏树令，朱小兵。退变腰椎间盘内细胞凋亡的检测与分析。中国临床解剖学杂志， ，23（1）：90-92
6. 李小川、付勤、贾长青。一氧化氮合酶抑制剂对延缓腰椎间盘退变的潜在意义。中华实验外科， ，22（4）：81-83
7. 李小川、付勤、贾长青。一氧化氮合酶抑制剂对退行性变腰椎间盘基质代谢的影响。中国临床康复， ，9（6）：82-83 （BA收录）
8. 贾长青，柏树令，朱小兵 。腰椎间盘退变模型的建立及影像学观察。解剖学杂志。 ，27（3）：236-238
9. 贾长青，柏树令，朱小兵。脊柱内固定后椎间盘营养途径的实验研究。中国临床解剖杂志。 ，21（4）：359-361
2、 课题指导简介
柏树令，男，1945年11月30日生，满族，中共党员，教授、博士研究生导师。现任国务院学位委员会学科评议组成员、中国医科大学学位委员会副主席、中国医科大学基础医学院院长。
工作单位：中国医科大学；
家庭住址：沈阳市和平区南昌街18号862。
联系电话：（O）、（H）
社会兼职：中国解剖学会常务理事、教育工作委员会主任、人体解剖专业委员会副主任；中国修复重建外科专业委员会委员；《解剖学报》、《解剖学杂志》、《中国临床解剖学杂志》、《Journal of clinical Anatomy》、《解剖学研究》、《中国微循环杂志》和《微循环学杂志》的编委或常务编委；辽宁省解剖学会副理事长；中国医科大学解剖教研室副主任、中国医科大学组织工程学研究室主任。参加或主持国家自然基金、卫生部科学基金与省自然科学基金等各种科研基金共7项；获省政府科技进步一等奖2项；省部级科技进步三等奖5项；省部级教学成果奖2项。发表科研论文110余篇；主编7年制规划教材《系统解剖学》和大学本科规划教材《系统解剖学》第5版和第6版；主编《人体解剖学彩色图谱》和《皮瓣手术入路彩色图谱》各一部，主审《人体解剖学图谱》2部；参编科技专著3部。自1991年以来获得光荣称号有：沈阳市劳动模范；沈阳市优秀专家；沈阳市优秀共产党员；政府特殊津贴获得者；福建医科大学客座教授，暨南大学兼职教授；“做出突出贡献的中国博士学位获得者”；辽宁省优秀科技工作者；全国优秀教师。

六、进度安排及实施方案（包括运行机制）
.7～ .12 骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定。
.1～ .6 重组真核表示质粒pcDNA3-TGF-β1的构建和鉴定.
.7～ .9 TGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及转染后的鉴定：表示情况及转染效率
.10～ .12 异常应力环境兔腰椎间盘退变模型的建立及椎间盘退变的观察。
.1～ .6 观察转染的骨髓基质干细胞移植入退变椎间盘后的TGF-β1表示及椎间盘的修复情况。
.7～ .12 撰写论文.

七、预期成果和考核目标
预期成果：
1.异常应力的椎间盘退变模型的成功建立和存活。
2.成功体外构建以pcDNA3为载体的pcDNA3-TGF-β1质粒，并完成其表示、扩增，提高转染效率。
3.目的基因及其产物的稳定和持续的表示，良好地修复退变椎间盘。
4.从基因水平使椎间盘退变病因学研究进一步得到明确；
5.探索椎间盘退变基因治疗方法；早期抑制椎间盘退变的发展，促进退变的修复，避免由于椎间盘退变所致疾病，具有极其广阔的应用前景；
考核目标：
1． 在国内外相关的期刊上发表10篇文章
2． 申报成果及鉴定。

八、推广及应用前景
1、 异常应力环境下，椎间盘退变模型的成功建立，将使椎间盘退变病因学研究进一步得到明确；
2、 有助于椎间盘退变所致疾病基因治疗途径的探索；
3、 为临床上椎间盘突出症的病人的基因治疗提供理论基础和实验依据。

九、经费概算及来源；
经费来源：科技厅10万元
经费概算：调研培训费用：10000元（包括参加国内、国际交流，资料查新等）
能源材料费用：40000元（包括动物模型建立及动物培养，标本制备，细胞培养与检测，免疫组织化学与组织化学试剂，生物化学试剂，分子生物学试剂，pcDNA3-TGF-β1的构建、鉴定、扩增，基因转染、目的基因检测等）
业 务 费 用 ：30000元（细胞培养室升级；电镜、图片分析，资料、学术论文发表与制作等）
验收鉴定费用： 0元（用于科研成果鉴定费等）

十、 合作单位基本情况；

十一、申报资料附件清单；

十二、申请单位主管部门或市科技局意见。