L-抗坏血酸棕榈酸酯的酶法合成.pdf

350李红，陶静，李颖(郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450002)摘要:详细研究了脂肪酶在有机溶剂中催化合成 L抗坏血酸棕榈酸酯的反应，并且对影响产物浓度的几种主要因素进行讨论(如脂肪酶、溶剂、温度、底物比、添加剂)，首次通过加入相转移剂提高反应产物浓度，确定了合成 L抗坏血酸棕榈酸酯的最适反应条件:3mL 叔戊醇为溶剂，催化剂为 Novozyme435，其最佳用量为 0.05g，底物棕榈酸与抗坏血酸摩尔比31，0.3g 4A 分子筛作为吸水剂，0.3g 四丁基溴化铵作为相转移剂，反应温度50，反应时间72h，得到产物浓度为 16.6mg/mL。关键词:L抗坏血酸棕榈酸酯，Novozyme435，叔戊醇，四丁基溴化铵Synthesis of Lascorbyl palmitate catalyzed by lipaseLI Hong，TAO Jing，LI Ying(School of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)Abstract:The synthesis of Lascorbyl palmitate catalyzed by lipase in organic phase was studied.The optimizedprocess conditions，such as enzyme，solvent，temperature，reactants and additive were determined.In the presenceof 0.05g Novozyme435 as catalyst，0.3g of 4A molecular sieve and 0.3g of nBu4NBr as additive in 3mL tertamylalcohol at 50，16.6mg/mL of Lascorbyl palmitate was obtained in the reaction of palmitic acid and VCwith themolar ratio of 31 after 72h.Key words:Lascorbyl palmitate;Novozyme 435;tertamyl alcohol;tetrabutylammonium bromide中图分类号:TS202.3文献标识码:A文 章 编 号:10020306(2011)08035004收稿日期:20100107作者简介:李红(1978)，女，博士，副教授，主要从事食品化学方面的研究工作。基金项目:郑州轻工业学院 2008 年博士基金项目(000420)。随着人们生活水平的提高，人们对食品和食品添加剂的安全性越来越重视。L抗坏血酸棕榈酸酯(图 1)是近年来发现的一种新型“绿色”、多功能抗氧化剂。研究已表明，其安全性、稳定性和抗氧化性均优于目前常用的合成抗氧化剂 BHA、BHT 等，是世界卫生组织、食品药品联合委员会认可的营养型抗氧化剂，并为英国、美国药典收载，已被广泛应用于食品、医药、化妆品和纸制品等领域1 4。目前，L抗坏血酸棕榈酸酯合成方法主要有直接酯化法56、酯交换反应法78、酰卤酯化法9 及酶催化合成法1013，其中，酶催化合成法由于具有选择性高、副反应少、反应条件温和、产品下游分离操作相对简单、对设备要求不高等优点，符合清洁生产、绿色化工的发展趋势，越来越受到人们的重视1013。国内汤鲁宏14 等研究了叔戊醇中 NOVO 435 催化下 L抗坏血酸棕榈酸酯的合成，产物浓度仅 12.5g/L。于是，通过改变反应条件，提高产物浓度，成为酶法合成 L抗坏血酸棕榈酸酯研究热点之一。本文针对该反应为可逆反应，考虑通过加入一定量的吸水剂调节反应体系中的水分含量，使反应向正方向进行，此外，水分含量的不同，将影响到反应体系中的酶活力，进而影响反应产物浓度;同时，因原料中棕榈酸为脂溶性，而L抗坏血酸为水溶性的溶解性特点，于是设想能否通过加入一定量的相转移剂增加有机相中 L抗坏血酸的量来促进反应进行，实现对酶法合成 L抗坏血酸棕榈酸酯工艺的优化。图 1L抗坏血酸棕榈酸酯1材料与方法1.1材料与仪器NOVO 435 脂肪酶、LIPOLASE 脂肪酶、TLIM 脂肪酶河南工业大学油脂化学研究室赠送;棕榈酸、L抗坏血酸、叔戊醇、己烷、氨水、氯化铵、浓盐酸、钼酸铵、硅酸钠、4A 分子筛、四丁基溴化铵、无水硫酸钠均为分析纯。BS200S 型电子天平北京赛多利斯天平有限公司;852 型恒温磁力搅拌器江苏中大仪器厂;754型紫外可见分光光度计上海第三分析仪器厂;HG1011B 电热鼓风干燥箱南京实验仪器厂;WC3511 型显微熔点仪温度未校正，上海光学仪器厂;Bruker VECTOR22 型红外光谱仪德国布鲁克公司;Agilent LC/MSD Trap XCT 质谱仪美国 Agilent公司。1.2L抗坏血酸脂肪酸酯的合成方法在由 0.5mmol(0.088g)抗 坏 血 酸 和 1.5mmol(0.384g)棕榈酸，3mL 溶剂组成的反应体系中，分别加入 0.05g 脂肪酶、0.3g 吸水剂、0.3g 相转移剂四丁基溴化铵，在 50 的恒温水浴中反应，控制转速200r/min，反应 72h 后产物浓度用硅钼兰分光光度法15 测定。1.2.1脂肪酶的选择在 25mL 具塞长试管中分别加入 0.088g(0.5mmol)抗坏血酸、0.384g(1.5mmol)的棕榈 酸、0.05g 脂 肪 酶(NOVO435、LIPOLASE 和TLIM)、3mL 叔戊醇，将试管放入转速为 200r/min、温度为 50的恒温磁力加热搅拌器中反应，72h 后取样检测。1.2.2加酶量的选择在温度为 50，200r/min，3mL 叔戊醇体系，棕榈酸与 L抗坏血酸的摩尔比为31，加入0.3g 吸水剂、0.3g 相转移剂四丁基溴化铵条件下，分别加入 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06g 脂肪酶 NOVO435，反应 72h 后取样检测。1.3L抗坏血酸脂肪酸酯的红外光谱测定红外光谱用 Bruker VECTOR22 型红外光谱仪测定，KBr 压片，扫描范围 4000500cm1。1.4L抗坏血酸脂肪酸酯的质谱测定条件质谱由 Agilent LC/MSD Trap XCT 质谱仪测定，采用电喷雾 ESI 离子源;电子能量 70eV;传输线温度275;离子源温度 200;采用负离子模式，母离子m/z 413;激活电压 1.5V;质量扫描范围 m/z 0650。2结果与讨论2.1脂肪酶的选择考察了 NOVO 435，LIPOLASE，TLIM 三种脂肪酶对 L抗坏血酸棕榈酸酯合成反应的催化效果，结果见图 2。图 2脂肪酶对酯化反应产物浓度的影响由图 2 可以看出，LIPOLASE 脂肪酶几乎不存在催化此反应的功能，TLIM 催化效果也比较差，72h后，产物浓度仅 0.04mg/mL，NOVO 435 催化此反应的效果最好，72h 之后，产物浓度可达 3.24mg/mL，因此，选择 NOVO 435 作为酯化反应的催化剂。2.2吸水剂对酯化反应产物浓度的影响由于 L抗坏血酸棕榈酸酯合成反应是可逆反应，而且产物中有水生成，因此，考虑将反应体系中加入一定量的吸水剂，促使反应向正方向进行;此外，水分活度的不同，也将影响到反应体系中的酶活力，进而影响反应产物浓度，于是我们考察了无水Na2SO4及活化的 4A 分子筛对反应产物浓度的影响，结果见图 3。从图 3 可以看出，吸水剂无水 Na2SO4及 4A 分子筛的加入可以明显地促进反应的进行，且加入 4A分子筛要比加入无水 Na2SO4效果更好，一方面是因为吸水剂的加入有助于反应向生成产物的方向进行;另一方面可能是因为吸水剂的加入调整了反应体系的水分活度，更适于脂肪酶作用。因此，我们选择加入 4A 分子筛作为吸水剂。图 3吸水剂对酯化反应产物浓度的影响2.3反应溶剂的选择反应溶剂作为酶反应的介质直接影响酶的催化活性和稳定性。不仅如此，溶剂还能改变酶的特异性。酶在不同的有机溶剂中活力差别很大，酶活力和溶剂之间可能存在着某种定量关系模型。而且，L抗坏血酸棕榈酸酯的合成反应与一般的有机相合成反应有所不同，其底物是由 L抗坏血酸和棕榈酸组成，而 L抗坏血酸极性很强，棕榈酸非极性很强，因此要获得高浓度的产物，就要求反应结束时，L抗坏血酸和棕榈酸的浓度都非常高，该反应需选择一种亲水性溶剂，即有一定极性，对抗坏血酸有一定溶解性，以保证从理论上获得的产物浓度较高，同时极性又不宜太强，否则将造成酶的失活。于是研究了分别以水、叔戊醇、正己烷作为反应溶剂，结果见图 4。图 4溶剂对酯化反应产物浓度的影响从图 4 看来，水不适合作为此反应的介质。当反应在非极性较强的正己烷中反应时，可能由于溶解度的原因，虽然很适合酶的催化反应，但对抗坏血酸的溶解性较差，导致产物浓度依然很低。于是选择极性处于两者之间的叔戊醇，得到的产物浓度最高。2.4相转移剂对酯化反应产物浓度影响在 L抗坏血酸与棕榈酸的酯化反应中，L抗坏血酸是水溶性的，而棕榈酸是脂溶性的，两种反应物处在不同的相中，反应不容易进行。于是考虑通过加入一定量的相转移剂四丁基溴化铵，增加 L抗352坏血酸在叔戊醇相中的溶解度，加速反应，结果见图5。由图 5 可以看出，加入四丁基溴化铵后，产物浓度有所提高，因此，我们选择加入一定量的相转移剂四丁基溴化铵。图 5相转移催化剂对酯化反应产物浓度的影响2.5反应温度对酯化反应产物浓度的影响温度对 NOVO 435 酶催化 L抗坏血酸与棕榈酸的酯化反应的影响如图 6 所示。图 6温度对酯化反应产物浓度的影响由图 6 可见，温度对 L抗坏血酸棕榈酸酯的合成有较大的影响，温度升高有利于该反应进行。当温度在 30 50 时产物浓度迅速上升，在温度为50时产物浓度达到最高。但温度超过 50 时，随着温度的继续升高，L抗坏血酸棕榈酸酯的产物浓度反而有所下降，主要是因为温度过高使脂肪酶NOVO435 逐渐失活，此外，温度过高也会破坏抗坏血酸的结构，进而影响产物浓度。于是将反应温度控制在 50为宜。2.6底物比的选择脂肪酶催化该酯化反应是 L抗坏血酸和棕榈酸反应生成酯和水的反应。要使反应彻底，就必须使反应物过量，或在反应中除去某产物，由于 L抗坏血酸微溶于叔戊醇，且反应结束后，仍有部分固态 L抗坏血酸，它在反应中的浓度可视为定值，因此，可以通过增加棕榈酸的量促使反应进行。本实验通过改变棕榈酸与 L抗坏血酸的摩尔比，考察对产物浓度产生的影响，结果如图 7 所示。图 7底物摩尔比对酯化反应产物浓度的影响由图 7 可见，体系中 L抗坏血酸棕榈酸酯的浓度随着棕榈酸和 L抗坏血酸的摩尔比增大而增大，但当摩尔比超过 31 时，反应产物浓度变化已经不明显，说明此时酶已经被底物饱和，体系中过量的棕榈酸对反应影响较小，因此，选择最适棕榈酸和 L抗坏血酸的摩尔比为 31。2.7体系中加酶量的选择脂肪酶固体颗粒直接悬浮于有机溶剂中，酶的加入量对于反应进程有相当大的影响。结果如图 8所示。由图 8 可知，体系中 L抗坏血酸棕榈酸酯的质量浓度随酶 NOVO 435 量的增大而增加，当加酶量达到 0.05g 时，继续增加脂肪酶的用量，反应产物的质量浓度增加缓慢，说明，此时酶已经相对底物过剩。因此，体系中最适的加酶量为 0.05g。图 8酶浓度对酯化反应产物浓度的影响2.8反应时间对酯化反应产物浓度的影响体系中 L抗坏血酸棕榈酸酯的质量浓度随时间的变化情况如图 9 所示。图 9时间对酯化反应产物浓度的影响由图 9 可以看出，反应时间在 72h 内，L抗坏血酸棕榈酸酯的浓度迅速上升，超过 72h 后，产物浓度升高缓慢，说明此时反应已经趋于平衡，再延长时间并不能有效增加体系中 L抗坏血酸棕榈酸酯的质量浓度，因此，选择最佳反应时间为 72h。2.9产物的结构鉴定由酶催化提纯得到的产品为白色粉末，用熔点仪测定其熔点为 110113，在文献报道的熔点范围内(107117)。从红外光谱图(图 10)中可以看出，在 3404cm1处 出 现 OH 的 吸 收 峰，在 2918、2850cm1处出现 CH2的 C H 伸缩振动吸收峰，在1733cm1处出现羧酸酯基伸缩振动吸收峰，1660cm1附近的吸收峰为 L抗坏血酸中 C=C 双键的吸收峰;指纹区的吸收峰(1466、1300、719cm1)进一步提供了佐证，符合 L抗坏血酸棕榈酸酯的结构特征。质谱图(图 11)中的分子离子峰 413.2(M1)更加证实了产品即为 L抗坏血酸棕榈酸酯。(下转第 417 页)417培养法，所以我们可以借鉴一些国外方法，提高检测效率，或者将国内和国外的方法相结合，但阳性结果的样品必须按国标方法做证实实验方可报告结果。参考文献 1贺连华，吴平芳，刘涛.食品中沙门菌检验方法的优化与应用 J.实用预防医学，2008，15(5):15751576.2 Cheng CM，Lin W，Van KT，et al.Rapid detection ofSalmonella in foods using realtime PCR J.Food Prot，2008，71(12):24362441.3王耀，郑秋月，曹际娟.SYBRTMRGreen实时 PCR 快速检测沙门氏菌 J.中国食品卫生杂志，2006，18(4):314317.4吉林省疾病预防控制中心，河南省疾病预防控制中心，广西壮族自治区疾病预防控制中心，等.GB 4789.42008，食品卫生微生物学检验沙门菌检验S.北京:中国标准出版社，2008:16.5SN/T 1538.22007.培养基制备指南S.第 2 部分:培养基性能测试使用指南.6SN/T 1538.12005.培养基制备指南S.第 1 部分:实验室培养基制备质量保证通则.7中国生物制品标准化委员会.中国生物制品规程(2000年版)M.北京:化学工业出版社，2000.8 ISO/TS 11133 2:2003.Microbiology of food and animalfeeding stuffsGuidelines on preparation and production of culturemediaS.Part 2:Practical guideline on performance testing ofculture media.9 NormeISO6579，Directivesgeneralesconcemantlesmethodesde re cherchb des Sa lmonella，AFNORS.December，1993，5.10CURIALE，et al.Journal of AOAC J.1997，80:檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾469504.(上接第 352 页)图 10L抗坏血酸棕榈酸酯的红外光谱图 11L抗坏血酸棕榈酸酯的质谱图3结论本文研究了一种合成 L抗坏血酸棕榈酸酯的方法，通过对催化合成 L抗坏血酸棕榈酸酯反应的酶种类和 介 质 进 行 筛 选，发 现 在 叔 戊 醇 溶 剂 中 用NOVO435 催化 L抗坏血酸与棕榈酸的酯化反应得到的产物浓度最高;同时，对影响合成 L抗坏血酸棕榈酸酯的因素(温度、吸水剂、相转移剂、底物比、酶浓度、反应时间)进行探讨，得到了脂肪酶催化合成L抗坏血酸棕榈酸酯的最佳反应条件为:3mL 叔戊醇作为溶剂，棕榈酸与 L抗坏血酸的摩尔比为 31，酶 NOVO435 用量为 0.05g，以 0.3g 4A 分子筛作为吸水剂，0.3g 四丁基溴化铵作为相转移剂，在 50 下，反应 72h，反应产物浓度可达 16.6%。参考文献 1 R K K Nippon.Antioxidant activity of ascorbic acid andascorbyl palmitate J.New Food Ind，1991，33(6):613.2耿志明.L抗坏血酸棕榈酸酯特性和应用 J.江苏食品与发酵，1997(1):3136.3 D Gopinath，D Ravi，B R Rao.Ascorbyl palmitate vesicles(Aspasomes):formation，characterization and applications J.International Journal of 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