乙肝六项操作及检验结果的解释.ppt
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1、 乙肝六项的操作乙肝六项的操作(cozu)、注意事项、注意事项及检验结果的解释及检验结果的解释第一页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作(cozu)HBSAg (双抗体夹心法)双抗体夹心法)原理原理在微孔条上预包被,被纯化的乙肝表面抗体,配以酶标记抗体(HBsAb-HRP)及TMB等其它试剂,采用夹心(jixn)法原理检测人血清(或血浆)中乙肝表面抗原(HBsAg)。第二页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作HBSAg (双抗体双抗体(kngt)夹心法)夹心法)操作步骤一.准备1.1平衡:将试剂盒各组分别取出,平衡至室温(18-25),1.2配液:浓缩洗涤液配制前充分摇匀(如有晶体应充分溶
2、解),浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按25倍稀释后使用(shyng)。1.3编号:将微孔条固定于支架,按序编号。第三页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作HBSAg (双抗体双抗体(kngt)夹心法夹心法)二.HBSAg操作2.1加样:分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各75l于相应孔中。2.2温育:置37温育60分钟。2.3 加酶:不用洗涤,分别在每孔中加入酶标记抗体50l,轻轻混匀。2.4 温育:置37温育30分钟,室温平衡5分钟。2.5 洗涤:用洗涤液充分(chngfn)洗涤5次,洗涤完扣干(每次应保持30-60秒的浸泡时间)。2.6显色:每孔加入底物A、B各50l,轻拍混匀,置
3、37暗处30分钟。2.7终止:每孔加终止液50l,混匀。三.HBSAg测定用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值(用单波长测定时需设空白对照一孔,30分钟内完成测定,并记录结果)。第四页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作HBSAg (双抗体(kngt)夹心法)结果判断与分析结果判断与分析(fnx)临界值(C.O.)的计算:Cutoff临界值=阴性对照孔OD值N2.1,阴性对照OD均值大于0.05时按实际OD值计算,小于0.05时以0.05计算。结果判定:样品OD值S/C.O=1者为HBsAg阳性样品OD值S/C.O1者为HBsAg阴性第五页,共三十五页。乙肝六项操
4、作乙肝六项操作(cozu)HBeAb检测(检测(ELISA)竞争法竞争法 一一.试剂准备同上试剂准备同上 二.HBeAb操作 加样:分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各50l于相应孔中。加酶:分别在每孔中加入酶标记抗体50l,轻轻混匀。温育:置37温育30分钟,室温平衡5分钟。洗涤:用洗涤液充分洗涤5次,洗涤完扣干(每次应保持30-60秒的浸泡时间(shjin))。显色:每孔加入底物A、B各50l,轻拍混匀,置37暗处15分钟。终止:每孔加终止液50l,混匀。三.HBeAb测定用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值(用单波长测定时需设空白对照一孔,30分钟内完
5、成测定,并记录结果)。第六页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作(cozu)HBeAb检测(检测(ELISA)竞争法竞争法 四四.结果判断与分析结果判断与分析临界值(C.O.)的计算:临界值(阴性对照孔OD值N+阳性对照孔OD值P)0.5,结果判定:样品(yngpn)OD值S/C.O1者为HBeAb阴性注意:注意:加底物显色,显色的强弱与待测标本中HBeAb的含量成反比。第七页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作(cozu)HBCAb测定(竞争法)测定(竞争法)原理原理在微孔条上预包被,被纯化乙肝核心抗原(HBcAg),配以酶标记抗体(HbcAb-HRP)及TMB等其它试剂,采用(ciyn
6、g)竞争抑制法原理检测人血清(或血浆)中乙肝核心抗体(HBcAb)。第八页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作(cozu)HBCAb测定(竞争法)测定(竞争法)试剂准备同上试剂准备同上加样加样:每测定孔加入50l样品。对照孔中加入阴、阳性对照血清各50l。作为临床诊断依据,必须将原倍血清样品按1:30稀释后再检验,稀释液应采用生理盐水;(作为流行病学调查依据,使用原倍血清检验)。加酶加酶:每孔加入酶标记抗体50l,轻拍混匀。育温:育温:置37温育30分钟,室温平衡5分钟。洗涤洗涤:用洗涤液充分洗涤5次,洗涤完扣干(每次应保持30-60秒的浸泡时间)。显色:显色:每孔加入底物A、B各50l,轻
7、拍混匀,置37暗处30分钟。终止:终止:每孔加终止液50l,混匀。测定:测定:用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值(用单波长测定时需设空白对照一孔,30分钟内完成测定,并记录结果(ji gu))。结果判断与分析结果判断与分析临界值(临界值(C.O.)的计算:)的计算:临界值阴性对照孔OD值N0.5(未稀释临界值阴性对照孔OD值N0.3)结果判定:样品OD值S/C.O1者为HBcAb阴性 注意:注意:加底物显色,显色的强弱与待测标本中HBCAb的含量成反比。第九页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作(cozu)HBCAb-lgM(捕获法)捕获法)测定原理测定原理采用
8、兔抗人HbcAg-IgM包被固相载体反应板,加入待测标本,同时加入HbcAg-HRP,当标本中存在HbcAb时,该HbcAb-IgM与包被HbcAg结合并与酶结合形成HBcAg-HbcAb-HBcAg-HRP复合物,加入TMB底物产生显色(xin s)反应,反之则无显色(xin s)反应。第十页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作(cozu)HBCAb-lgM(捕获法)捕获法)操作步骤操作步骤 1.待测样品用生理盐水作1:1000稀释,每孔加人稀释样品100微升,设阴、阳性对照各2孔,每孔加人阴性对照(或阳性对照)各100微升(或2滴),并设空白对照1孔,封板,置37 孵育20分钟。2.手工
9、洗板:弃去孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置5秒,甩干,重复3次后拍干。洗板机洗板:选择洗涤3次程序洗板后拍干。3.每孔加入HBcAg30微升(或1滴),酶结合物50微升(或1滴)(空白对照孔除外),充分混匀,封板,置37孵育20分钟4.手工洗板:弃去孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置5秒,甩干,重复5次后拍干。洗板机洗板:选择洗涤5次程序洗板后拍干。5.每孔加显色剂A液,显色剂B液各50微升(或l滴)充分混匀,封板,置37 孵育10分钟。6.每孔加人终止液50微升(或1滴),混匀。7.用酶标仪读数(dsh),取波长450nm(建议使用双波长的酶标仪比色,参考波长630nm),先用空白孔校零,然后
10、读取各孔OD值。记录结果)。第十一页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作(cozu)HBCAg-lgM(捕获法)捕获法)8.结果判断与分析结果判断与分析8.1 临界值(C.O.)的计算(j sun):临界值阴性对照孔OD值N4,阴性对照OD均值小于0.05时以0.05计算(j sun),大于0.05时应实际OD值计算(j sun)。8.2 结果判定:样品OD值S/C.O=1者为阳性 样品OD值S/C.O1者为阴性9.质量控制质量控制:每次均应有阴阳对照,其OD值应在要求范围内。第十二页,共三十五页。乙肝六项操作乙肝六项操作(cozu)HBCAb-lgM(捕获法)捕获法)10.参考值范围:参考
11、值范围:参考值cut-off value(COV)=阴性(ynxng)对照平均OD值x 4阴性对照OD值低于0.050作0.050计算,高于0.050按实际OD值计算。示例1:阴性对照孔1 COV:0.016.阴性对照孔2 COV:0.010.0.05040.200示例2:阴性对照孔 COV:0.056 阴性对照孔 COV:0.060(0.056+0.060)/240.232第十三页,共三十五页。ELISA法检测乙肝六项的注法检测乙肝六项的注意事项意事项 及结果及结果(ji gu)分析分析 酶联免疫吸附试验(简称 ELISA 法)检测乙型肝炎免疫学标志物问世以来,由于测定灵敏高、特异好和操作简
12、便等诸多优点,具有实用性和可操作性,并广泛应用于各类医院实验室,作为检测乙肝血清标志物的首选,但通过对临床乙肝六项检测的观察、存在不同血清物质变化及各种影响因素,直接或间接的影响检验(jinyn)结果的正确表达。综合资料和实践,作如下探讨:第十四页,共三十五页。1 样本的采集样本的采集(cij)与处理影响与处理影响1.1 样本(yngbn)离心处理不全,使得标本严重溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净,残留在孔内的血红蛋白,具有过氧化物酶样的活性,催化底物显色造成假阳性,溶血标本禁用。第十五页,共三十五页。1.2 正常血液(xuy)采集后半个小时至两小时开始凝固,有时工作中为
13、了快速检测,常会在血液(xuy)未开始凝固时,即强行离心分离血清。特别是在冬天 使得血清中残留部分纤维蛋白原,在 ELISA 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白凝块附着在酶标反应孔壁内使得不易洗掉 易造成假阳(阴)性、影响结果。因此血液标本采集后要使其充分凝固后再分离血清,标本离心时,可加大离心转速,延长离心时间 或者要节约时间就用带分离胶的采血管采集标本。第十六页,共三十五页。1.3 血清标本应避免细菌污染,细菌的一些内源性酶本身会对相应(xingyng)酶作标记测定方法产生干扰。1.4 标本储存(chcn)时间不宜过长,应新鲜 4 保存不宜超过7天,以免因标本中的 IgG 聚合导致本底加
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